Chagas 질병의 trypanosoma cruzi 에이전트는 임상 인식한 병리학으로 열릴 수 있는 오래 지속되는 현상 감염을 생성할 수 있습니다. 샤가스 질병으로 사망한 소년의 반열성 튜브에 있는 Trypanosoma cruzi 둥지의 발견은 Chagas 기생충의 가능한 성적인 전송을 해명하기 위하여 연구 프로토콜을 건의합니다. 5 년의 기간 동안 건강 관리를 제공하고 급성 Chagas 질병, ACG의 임상 증상을 가진 참가자를 보여주는 가족을 모집합니다.
1년 간격으로 3회, 5마일 알리쿼트로 나누어 4가지 센티그라드에 보관하여 1년에 세 번의 가족 참가자의 정맥 혈15ml를 획득했습니다. 성인 자원 봉사자로부터 혈청 사정 2 ml를 수집한 것은 분자 적 고의를 확인하기 위해 ACG 케이스의 혈액에 T.cruzi를 보여줍니다. ACG 혈액 알리쿼트에서 T.cruzi를 분리하여 항응고제로 멸균 10ml 튜브에 저장됩니다.
50ml 튜브 슬랜트에 혈액 5ml를 접종하고 간 주입 트립토세 배지 5 ml를 접종하고 3 개월 동안 27 Centigrades에서 셰이커에 배양합니다. 유리 슬라이드에 있는 상체의 100 마이크로리터에서 T.cruzi에 대한 현미경 검사를 검색합니다. 1, 000 x G에서 10분 동안 중간 원심분리기에서 표기를 수확하고 PBS pH 7.4로 세척합니다.
접종 75 ml L6 근육 세포 배양 플라스크 각각 10 에 여섯 번째 T.cruzi 격리. 37 센티그레이드에서 덜벡코 최소 필수 매체, DMEM 15 ml로 배양 세포를 공급한다. 기생충 격리 및 긍정적 인 제어 베레니스 T.cruzi를 성장.
DMEM에서 T.cruzi 상대인 리슈마니아 브라질을 부정적인 통제로 성장시다. 마우스를 감염시키기 위해 T.cruzi trypomastigotes 유래 여섯 번째 조직 배양에 10 x 10을 사용합니다. 한 달 후 재생의 근육과 장기의 섹션에서 T.cruzi의 둥지를 검색할 수 있습니다.
EDTA 코닝 멸균 10ml 튜브에 혈액 알리쿼트를 사용하고 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 백세포를 수집하여 3, 000 x G에서 45분 동안 수집합니다. PBS와 원심분리기로 다른 튜브에서 10분 동안 1, 500 x G로 셀을 두 번 씻으십시오. L.브라질iensis에서 베레니스 T.cruzi에서 보낸 격리에서 DNA를 추출 109 가족 과목에서 및 정자에서 21 참가자에서 3.3 프로토콜의 단계에서와 같이.
DNA 농도를 0.8%의 아가로즈 겔로 측정하고 206 나노미터에서 흡수하였다. T.cruzi TCZ를 사용하여 PCR 분석에서 188뉴클레오티드 프로브에 두 개의 프라이머 탄음제 탄자를 대시한다. PCR를 10 나노그램 템플릿 DNA, 각 프라이머 의 0.4 마이크로몰라, 2개의 단위 스톡 DNA 폴리머라제, 0.2 마이크로몰러 DNA-TP, 5 마이크로몰라 마그네슘 염화물 25 마이크로리터 최종 부피와 혼합합니다.
단계 3.5.2에서와 같이 DNA 증폭을 수행하고 젤에 DNA 밴드를 표시한다. T.cruzi 188 뉴클레오티드 프로브 멸음은 현재까지 알파 32P dATP로 프라이머 라벨을 사용하고 PCR 제품을 1.3%의 아가로즈 젤로 분리하고 양전하 나일론 막으로 이송한다. 멤브레인을 세척하고 이제 가변 기간 동안 X 선 필드에 노출됩니다.
X선 필드에서 선택한 클론을 성장시키고 TCZ 1 대시 두 프라이머로 상업적으로 시퀀스를 설정합니다. 3개의 독립적인 면역형광 분석약을 실시하고 109명의 연구 참가자에게서 PBS에 있는 1-100혈청 희석을 삼중화합니다. 원심 분리는 밀폐 된 혈액의 5 ml 알리쿼트에 1, 000 x G에서 30 분 동안 보관하고 영하 20 Centigrades에 혈청을 저장합니다.
1년 간격으로 3회에 획득한 연구 샘플에서 독립적인 면역형광 혈청 희석제를 실행한다. 공식적으로 배양 된 T.cruzi amastigotes 또는 L.braziliensis promastigotes의 5 마이크로 리터를 사용 하 여, PBS 서스펜션에서 마이크로 리터 당 10 기생충 유리 슬라이드에 하룻밤 건조 하자, 단계처럼 5.3.3. 1~100개의 혈청 희석제 100마이크로리터로 유리에 기생충을 배양하고 37Centigrades에서 1시간 동안 촉촉한 챔버에 미끄러져 커버한 다음 PBS로 두 번 세척합니다.
공기 건조 유리 슬라이드를 인간 IgG에 형광소 라벨 토끼 항체를 1-000 희석하여 세척하고 건조시킵니다. 커버 슬립으로 유리 슬라이드를 마운트하고 UV 광 현미경으로 검사합니다. T.cruzi 및 L.브라질iensis 용해 항원 1 마이크로그램을 탄산완충제 pH 9.6의 100 마이크로리터에서 검출한다.
삼중 구단 우물에서 1~100개의 혈청 희석제100마이크로리터를 배양합니다. PBS-Tween 용액으로 접시를 두 번 씻고 건조할 때까지 기다립니다. 알칼리인포스파아제 공주게이트, 염소 안티래빗 IgG의 1-000 마이크로리터 100마이크로리터로 배양한다.
PBS-Tween으로 접시를 두 번 씻고 기질 파라 니트로 페닐포스페트를 추가하고 색상 개발을 기다립니다. 멀티 모드 플레이트 판독기에서 630 나노미터의 광학 밀도를 읽으십시오. 비옥한 닭 알을 비조명하고 거품에 껍질에 구멍을 만들.
모의 대조알의 각 쉘 배양 배지에 100개의 트립포마스티고트를 접종한다. 접착제 테이프로 구멍을 밀봉합니다. 계란을 37 센티미터, 21 일 동안 65 %의 습도에서 배양하십시오.
모의 대조군, 그룹 B, T.cruzi 접종 계란, 그룹 C에서 성인 생활까지 라이브 제어 계란 그룹 A에서 부화 병아리를 성장. 그룹 B와 C의 닭에 두 번 도전 10 x 10 일곱 번째 공식적으로 배양 trypomastigote 매주. 도전 후 5주 후에 A, B, C 닭의 날개 정맥에서 정맥 혈액 2ml를 얻습니다.
혈청을 분리하고 T.cruzi 항체를 검출하기 위해 면역 형광 분석기를 실행합니다. 우수한 주거, 음식 및 급수로 동물 복지를 확보하십시오. 정액은 성인으로부터 사정하고, APCR 양성 차가스 질환 케이스를 사용하고, 프로토콜의 1.5 단계에서와 같이 대조군 대상으로부터.
복막과 쥐의 질에 정액의 100 마이크로 리터 알리쿼트 주입. 부모와 자손 마우스에서 T.cruzi 감염의 성적 전송. 급성 Chagas 질병에서 Trypanosoma cruzi의 발자국은 무선 표지 프로브와 사전에 형성하는 nDNA-PCR 제품에 의해 나타났다.
T.cruzi의 표현형은 면역 형광 분석으로 드러냈습니다. 안티 T. 크루지 항체는 L.브라질엔시스를 인식하지 못합니다.
ELISA 및 nDNA-PCR 어약의 그래픽 표현. 각각 1개와 2개를 그룹별로 그룹, 음수 및 긍정적 인 제어. 그룹 3, 양성 nDNA-PCR 및 특정 항체 분석.
nDNA-PCR에 의해 검출되었지만 특정 항체가 없는 경우 T.cruzi 감염을 가진 그룹 4. 그룹 5, 감염 무료 참가자. 가족 인구의 이발및 매핑은 항T의 비율 중 불일치를 보였다.
크루지 항체와 nDNA-PCR 의 그. 오픈은 정사각형과 원, 네거티브 남성과 여성입니다. 안티 T와 빨간색.
크루시 항체 및 nDNA-PCR 양성. 블랙, 긍정적 인 nDNA-PCR 혼자. T.cruzi 접종 계란에서 부화 닭의 면역 내성.
A, 모의 제어, B, T.cruzi 항원도전 살아있는 통제 닭. C, T.cruzi에서 부화 닭은 특정 항원과 도전 후 계란을 접종. T.cruzi의 감염성은 정액이 복막 구멍으로 그리고 질로 주입시 보여주었습니다.
이 스틸의 3 주를 희생 마우스는 심장에 있는 amastigote 둥지를 보여주었다, 골격 근육에서, 그리고 꽃병 deferens 및 자궁 관에. 마우스 모델 시스템에서 T.cruzi 감염의 성적 전송. T.cruzi 감염 된 남성과 여성, 순진한 동료에 감염을 전송.
T.cruzi 감염은 부모로부터 자손 마우스로 수직으로 옮겨졌습니다. 남부 블로팅은 F1 쓰레기의 대부분에서 기생충 협심증 밴드를 공개했다. 면역페로시다제 스테인 T.cruzi amastigotes는 반성 마우스의 반열성 관의 루멘으로 반열성 관의 중간 및 중간질에서 engoniablast를 보였다.
Chagas 질병의 21의 심각한 케이스에 있는 원생조의 기생증은 모든 감염된 과목에 있는 T.cruzi 발자국을 확인하기 위하여 결정적이었습니다. 기생충 항체 분석제의 비율 과 핵산 검사의 비율 중 불일치는 항체 없는 환자에 있는 발자국의 대다수를 밝혔습니다. 배아 발달 첫 주 후 T.cruzi에 반영된 닭 모델에서 의 넓은 차이는 잘 설명합니다.
면역 내성 성인 닭은 기생충 발자국을 보였지만 특정 항체가 없는 것으로 나타났습니다. Chagas 환자 사정에 있는 중요한 반대로 cruzi는 마우스 질과 복막 구멍으로 주입될 때 광범위하게 감염을 개시했습니다. 병리학은 심장과 골격 근육과 꽃병 연기및 자궁 관에 있는 T.cruzi amastigote 둥지를 보여주었습니다.
순진한 동료를 가진 Chagas 마우스의 사육은 감염한 암컷과 수컷이 감염되지 않은 순진한 동료에게 T.cruzi를 전송하고 그들의 쓰레기의 대다수는 자손에게 수직으로 전송된 감염을 취득했다는 것을 밝혔습니다. 가족 기반 프로토콜은 신뢰할 수있는 수혈 및 역학 조사를 수행하고 잠재적 인 지속적인 성병 Chagas 질병을 해명하기 위해 핵산 분석기를 다루었습니다.
