Трипаносома cruzi агент болезни Шагаса может производить длительные симптоматические инфекции, которые могут ворваться в клинически признанных патологии. Обнаружение гнезда трипаносомы крузи в семенной трубке мальчика, который умер от болезни Шагаса, позволяет предположить протокол исследования, чтобы разгадать возможную сексуальную передачу паразитов Шагаса. Обеспечить медицинское обслуживание в течение пяти лет и набирать семьи, показывая участников с клиническими симптомами острой болезни Шагаса, ACG.
Получил 15 мл венозной крови членов семьи в трех случаях один год друг от друга, разделенный на три, пять миль aliquots и хранить в четырех Centigrades. Собранные два мл эякулята сыворотки от взрослых добровольцев показывают T.cruzi в крови случаев ACG для проверки молекулярных анализов. Изолировать T.cruzi от ACG крови aliquot хранится в стерильной 10 мл трубки с антикоагулянтом.
Привить пять мл крови в 50 мл трубки наклоны плюс пять мл печени настой триптоз среды и инкубировать в шейкере на 27 Centigrades в течение трех месяцев. Поиск микроскопии для T.cruzi в 100 микролитер супернатанта на стеклянной горке. Урожай флагеллаты из среднего центрифугированные на 1000 х G в течение 10 минут и промывают в PBS рН 7,4.
Прививка 75 мл L6 мышечной клеточной культуры колбы каждый с 10 до шестого T.cruzi изолирует. Кормите клетки культуры 15 мл Dulbecco Minimal Essential Medium, DMEM на 37 Centigrades. Выращивайте изоляты паразитов и положительный контроль Беренис Т.крузи.
Выращивайте T.cruzi относительный Leishmania braziliensis в DMEM как отрицательный контроль. Используйте 10 х 10 до шестой культуры тканей, полученных T.cruzi трипомастиготы заразить мышей. Поиск гнезд T.cruzi в секциях мышц и органов воспроизводства через месяц.
Используйте кровяные алициты в EDTA Corning стерильной 10 мл трубки и собирать белые клетки по плотности градиент центрифугации на 3000 х Г в течение 45 мин. Вымойте клетки дважды с PBS и центрифуги на 1500 х Г в течение 10 минут в другой трубке. Извлекайте ДНК из изолята, отправленного из Беренис т.крузи из L.braziliensis из 109 субъектов семьи и из сперматозоидов от 21 участника, как в шаге 3.3 протокола.
Измерьте концентрацию ДНК на 0,8% геля агарозы и усваивается на 206 нанометров. Используйте T.cruzi ТЗЗ один тире два грунтовки аннеал 188 нуклеотидного зонда в анализе ПЦР. Сделать PCR смесь с 10 нанограмм шаблон ДНК, 0,4 микромоляра каждой пары грунтовки, две единицы запас ДНК полимеразы, 0,2 микромолярной ДНК-TPs, и 5 микромолярный хлорид магния в 25 микролитр конечного объема.
Проведи усиление ДНК как в шаге 3.5.2 и покажите полосы ДНК в геле. Используйте T.cruzi 188 нуклеотидный зонд anneals на сегодняшний день грунтовки этикетки с альфа 32P DATP и отделить продукт ПЦР на 1,3%agarose гель и передачи в положительно заряженной нейлоновой мембраны. Вымойте мембрану и теперь подвергайте рентгеновскому полю в течение переменных периодов.
Выращивайте клонов, отобранных из поля рентгеновских лучей, и последовательности на коммерческой основе с помощью T- one dash 2 грунтовки. Проведи три независимых анализа иммунофлуоресценции и в три раза разбавляю сыворотку в PBS от 109 участников исследования. Центрифуга пять мл aliquot закрытой крови на 1000 х Г в течение 30 минут и хранить сыворотку при минус 20 Centigrades.
Запуск независимых иммунофлуоресценции разбавления сыворотки из образцов исследования, полученных в трех случаях один год друг от друга. Используйте 5 микролитров формально инкубированных T.cruzi amastigotes или L.braziliensis promastigotes, 10 паразитов на микролитер в подвесках PBS на стеклянную горку и дайте ему высохнуть на ночь, как в шаге 5.3.3. Инкубировать паразита на стекле с 100 микролитров от одного до 100 разбавления сыворотки и накрыть скольжения во влажной камере в течение одного часа на 37 Centigrades, а затем мыть дважды с PBS.
Инкубировать высушенные на воздухе стеклянные горки с 1 до 1000 разбавления флуоресцента помечены кролика антитела к человеку IgG, мыть и сухой, а также. Намонтировать стеклянную горку с крышкой скольжения и изучить его под уф-микроскопом света. Обнаружить T.cruzi и L.braziliensis растворимый антиген один микрограмм в 100 микролитер карбонат буфер рН 9.6.
Инкубировать 100 микролитров от одного до 100 разбавления сыворотки в тройной четвертижных скважин. Вымойте пластины дважды с PBS-Tween решений и ждать, чтобы высохнуть. Инкубировать 100 микролитер от одного до 1000 разбавления щелочной фосфатазы конъюгат, коза анти-кролик IgG.
Вымойте пластины дважды с PBS-Tween, добавить субстрат пара-нитрофенилфоста и ждать развития цвета. Прочитайте оптическую плотность на 630 нанометров в многоступенчатом считыватель пластин. Трансиллюминировать плодородные куриные яйца и сделать отверстие в оболочке на их пузырь.
Привить 100 трипомастиготов на каждой оболочке культуры среды в макет контроля яйца. Запечатай отверстие клейкой лентой. Инкубация яиц при 37 Centigrades, 65%humidity в течение 21 дней.
Выращивайте птенцов, вылупившихся из живых контрольных яиц группы А из макетных элементов управления, группы В и из привитых яиц T.cruzi, группы С до их взрослой жизни. Вызов кур группы B и C в два раза с 10 х 10 до седьмого официально инкубировали трипомастигот еженедельно. Получить два мл венозной крови из крыла вены A, B и C кур через пять недель после вызова.
Разделите сыворотку и запустите анализатор иммунофлуоресценции для обнаружения антител T.cruzi. Обеспечение благополучия животных отличным жильем, питанием и водоснабжением. Используйте спермы эякулята от взрослого, и APCR положительный случай болезни Шагаса, и от контрольного субъекта, как в шаге 1,5 протокола.
Привить 100 микролитер aliquots спермы в брюшной полы и во влагалище мышей. Сексуальная передача инфекции T.cruzi у родительских и потомчих мышей. След Trypanosoma cruzi от острой болезни Шагаса показали nDNA-PCR продуктов, которые образуют заранее с радио помечены зонда.
Фенотип T.cruzi показал с иммунофлуоресценции анализа. Анти-Т. cruzi антитела не признают L.braziliensis.
Графическое представление ELISA и анализов nDNA-PCR. Группы 1 и 2 соответственно, отрицательный и положительный контроль. Группа 3, положительный nDNA-PCR и конкретные анализы антител.
Группа 4 с инфекциями T.cruzi, обнаруженными nDNA-PCR, но при отсутствии специфического антитела. Группа 5, инфекции свободных участников. Ередограммы и картирование семейного населения показали расхождения между соотношениями анти-Т.
cruzi антитела и те из NDNA-PCR анализы. Открытый квадрат и круг, отрицательный мужской и женский. Красный с анти-Т.
cruzi антитела и nDNA-PCR положительные. Черный, положительный nDNA-PCR в одиночку. Иммунная толерантность у кур вылупилась из привитых Т.крузи яиц.
A, макет управления, B, жить контролируемых кур оспаривается с антигеном T.cruzi. C, цыплята вылупились из привитых яиц T.cruzi после вызова с конкретным антигеном. Инфекционность T.cruzi показал на сперму внушает в брюшной полости и во влагалище.
Мыши пожертвовали три недели этих кадры показали амастигот гнездо в сердце, в скелетной мышце, и в сосудах deferens и в маточной трубки. Сексуальная передача инфекций T.cruzi в системе модели мыши. Т.крузи заразили самцов и самок, передав инфекцию наивным товарищам.
Инфекция Т.крузи вертикально передается от родительской к потомствам мышей. В южной blotting показали паразита ингинат полосы в большинстве F1 пометов. Иммунопероксидазы пятно T.cruzi амистиготы показали engoniablast и в интерстициальных эпидидимита и в люмен семенных труб потомков мышей.
Паразитологическая демонстрация простейшего в 21 остром случае болезни Шагаса имеет решающее значение для проверки следа Т.крузи во всех инфицированных субъектах. Расхождения между соотношениями анализа антител паразитов и анализов нуклеиновых кислот выявили большинство следов у пациентов, свободных от антител. Широкая разница хорошо объясняется в модели курицы отражается на T.cruzi после первой недели развития эмбриона.
Иммунная толерантность взрослых кур показали следы паразитов, но с отсутствием специфических антител. Жизненно важные анти-крузи в Chagas пациента эякуляции инициировал широко распространенные инфекции на внушает во влагалище мыши, а также в брюшной полости. Патология показала T.cruzi amastigote гнезда в сердце и скелетных мышцах и в сосудах deferens и утробной пробке.
Разведение мышей Шагаса с наивными товарищами показало, что инфицированные самки и самцы передавали Т.крузи неинфицированным наивным товарищам, и большинство их пометов приобрели инфекцию вертикально переданную потомкам. В семейном протоколе рассматривается анализ нуклеиновых кислот в целях проведения надежных исследований переливания крови и эпидемиологии и выяснения потенциальной продолжающейся болезни Шагаса, передаваемой половым путем.
