Chagas hastalığının trypanosoma cruzi ajan klinik tanınan patoloji içine açık kırabilir uzun süreli semptomatik enfeksiyonlar üretebilir. Chagas hastalığından ölen bir çocuğun seminiferous tüp Trypanosoma cruzi yuvaları bulma Chagas parazitlerin olası cinsel iletimi çözmek için araştırma protokolü göstermektedir. Beş yıllık bir süre için sağlık hizmeti sunun ve akut Chagas hastalığı, ACG klinik belirtileri ile katılımcılar gösteren, aileleri işe.
Bir yıl arayla üç kez aile katılımcılarının 15 ml venöz kan elde, üç, beş mil aliquots bölünmüş ve dört Santigratlarda saklamak. Yetişkin gönüllülerden serum boşalmak toplanan iki ml moleküler tahlilleri doğrulamak için AKG olgularının kanında T.cruzi gösterir. ACG kan aliquot T.cruzi izole antikoagülan ile steril 10 ml tüp saklanır.
50 ml tüp eğimleri artı karaciğer infüzyon triptose orta beş ml içine kan beş ml aşılamak ve üç ay boyunca 27 Santigratlarda bir shaker inkübat. Cam kaydıraktaki süpernatantın 100 mikrolitresinde T.cruzi için mikroskobu arayın. 10 dk için 1, 000 x G'de santrifüj edilen ve PBS pH 7.4 ile yıkanan orta santrifüjlerden kamçıları hasat edin.
Inoculate 75 ml L6 kas hücresi kültürü şişesi her biri ile 10 altıncı T.cruzi izole. Kültür hücrelerini 15 ml Dulbecco Minimal Essential Medium, DMEM ile 37 Santigrat'ta besleyin. Parazit izole ve pozitif kontrol Berenice T.cruzi büyümek.
Negatif kontrol olarak DMEM T.cruzi göreceli Leishmania braziliensis grow. Fareleri enfekte etmek için t.cruzi trypomastigotes türetilmiş altıncı doku kültürü için 10 x 10 kullanın. Bir ay sonra üreme kas ve organların bölümlerinde T.cruzi yuvaları arayın.
EDTA Corning steril 10 ml tüp kan aliquots kullanın ve 45 dk için 3, 000 x G yoğunluk gradyan santrifüj tarafından beyaz hücreleri toplamak. Hücreleri pbs ve santrifüj ile 1, 500 x G ile 10 dk boyunca farklı bir tüpte iki kez yıkayın. Berenice T.cruzi'den L.braziliensis'ten gönderilen izole den DNA'yı 109 aile deneğinden ve spermatozoadan 21 katılımcıdan protokolün 3.3 adımında olduğu gibi çıkar.
DNA konsantrasyonlarını %0,8 agarose jel üzerinde ölçün ve 206 nanometrede emilir. PCR analizinde 188 nükleotit probu için T.cruzi TCZ bir çizgi iki astar anneal kullanın. PCR karışımını 10 nanogram şablonDNA, her bir astar çiftinin 0,4 mikromolar, iki birim stok DNA polimeraz, 0,2 mikromolar DNA-TPs ve 25 mikrolitrelik son hacimde 5 mikromolar magnezyum klorür ile karıştırın.
3.5.2'deki gibi DNA amplifikasyonını gerçekleştirin ve jeldeki DNA bantlarını gösterin. T.cruzi 188 nükleotit probu anneallarını kullanarak alfa 32P dATP ile bugüne kadar astar etiketi ni kullanın ve PCR ürününü %1,3 agarose jel üzerinde ayırın ve pozitif yüklü naylon membrana aktarın. Membranı yıkayın ve şimdi değişken periyotlar için X-ışınları alanına maruz kın.
X-ışınları alanından seçilen klonları büyütün ve TCZ bir çizgi iki astar ile ticari olarak sırala. PBS'de 109 çalışma katılımcısından üç bağımsız immünoresans tahlilleri ve 1ila 100 serum seyreltme gerçekleştirin. 30 dk için 1, 000 x G kapalı kan beş ml aliquot santrifüj ve eksi 20 Santigratlarda serum saklayın.
Bir yıl arayla üç kez alınan çalışma örneklerinden bağımsız immünofloresan serum seyreltmeleri çalıştırın. Resmi olarak kuluçkaya yatan T.cruzi amastigotes veya L.braziliensis promastigotes 5 mikrolitre kullanın, cam slayt üzerine PBS süspansiyonlar mikrolitre başına 10 parazit ve bir gecede kurumasını bekleyin, adım 5.3.3 gibi. Camdaki paraziti 100 mikrolitre ile 100 ila 100 serum seyreltme ile kuluçkaya yatırın ve 37 Santigrat derecede bir saat boyunca nemli bir haznede kaydırın, ardından PBS ile iki kez yıkayın.
Havayla kurutulmuş cam slaytları 1'e kadar 1,000 seyreltme ile insan IgG'ye tavşan antikoru etiketlenmiş bir floresan, yıkama ve kuru teşekkül edin. Cam kaydırağı bir kapak fişi ile monte edin ve UV ışık mikroskobu altında inceleyin. Karbonat tampon pH 100 mikrolitre T.cruzi ve L.braziliensis çözünür antijen bir mikrogram tespit edin.
Üç aylık dörde kılmış kuyularda 100 mikrolitre lik 100 ila 100 serum seyreltme ile kuluçka. PBS-Tween çözeltileri ile plakaları iki kez yıkayın ve kurumasını bekleyin. 1-1, 000 alkali fosfataz konjuge, keçi anti-tavşan IgG seyreltme 100 mikrolitre ile kuluçka.
Plakaları PBS-Tween ile iki kez yıkayın, substrat para-nitrofenilfospate ekleyin ve renk gelişimini bekleyin. Optik yoğunlukları çok modlu plaka okuyucuda 630 nanometrede okuyun. Transilluminate verimli tavuk yumurtaları ve kabarcık kabuk bir delik yapmak.
Sahte kontrol yumurtalarında her kabuk kültür ortamına 100 trypomastigote aşılama. Deliği yapışkan bantla kapatın. Yumurtaları 37 santigrat, %65 nem de 21 gün kuluçkaya yatırın.
Canlı kontrol yumurtagrubu A'dan yumurtadan çıkan yavruları sahte kontrollerden, B grubu ve T.cruzi aşılanmış yumurtalardan yetişkin yaşamlarına kadar C grubu büyütün. B ve C grubu tavuklara haftada 10 x 10 ile yedinci resmi olarak kuluçkaya yatan trypomastigote ile iki kez meydan okuyun. A, B ve C tavuklarının kanat damarından venöz kandan iki ml alın.
Serumu ayırın ve T.cruzi antikorlarını tespit etmek için immünoresans analizörü çalıştırın. Mükemmel konut, gıda ve su temini ile güvenli hayvan refahı. Bir yetişkin den meni boşalmak kullanın, ve APCR pozitif Chagas hastalığı durumda, ve protokol adım 1.5 gibi bir kontrol öznesinden.
Periton ve farelerin vajina içine meni 100 mikrolitre aliquots aşındırın. Ebeveyn ve döl farelerde T.cruzi enfeksiyonunun cinsel iletimi. Akut Chagas hastalığından Trypanosoma cruzi ayak izi radyo etiketli prob ile önceden form nDNA-PCR ürünleri tarafından gösterdi.
T.cruzi fenotip immünororesans tsay ile ortaya. Anti-T. cruzi antikor L.braziliensis tanımıyor.
ELISA ve nDNA-PCR tahlillerinin grafik gösterimi. Gruplar bir ve iki sırasıyla, negatif ve pozitif kontrol. Grup üç, pozitif nDNA-PCR ve spesifik antikor tahlilleri.
Grup dört ile T.cruzi enfeksiyonları nDNA-PCR tarafından saptandı ama spesifik antikor yokluğunda. Grup beş, enfeksiyonsuz katılımcılar. Aile popülasyonunun heredogramları ve haritalamaları anti-T oranları arasında tutarsızlıklar gösterdi.
cruzi antikor ve nDNA-PCR tahlilleri. Açık kare ve daire, negatif erkek ve kadın. Anti-T ile kırmızı.
cruzi antikor ve nDNA-PCR pozitif. Sadece siyah, pozitif nDNA-PCR. Tavuklarda bağışıklık toleransı T.cruzi aşısı yumurtadan yumurtadan çıktı.
A, sahte kontrol, B, Canlı kontrollü tavuklar T.cruzi antijeni ile meydan okudu. C, tavukt.cruzi belirli antijen ile meydan sonra yumurta aşılanmış yumurtadan. T.cruzi enfekte periton boşluğuna ve vajina içine meni aşılar üzerine gösterdi.
Bu fotoğraflardan üç hafta kurban edilen fareler kalpteki, iskelet kasında, vazşeklinde ve rahim tüpünde amastigote yuvasını gösterdiler. Fare modeli sisteminde T.cruzi enfeksiyonlarının cinsel iletimi. T.cruzi enfekte erkek ve dişiler, naif arkadaşları için enfeksiyon iletilir.
T.cruzi enfeksiyonu dikey olarak ebeveynden nesilli farelere aktarılır. Güney lekeleme F1 çöp çoğunluğunda parazit anjinit bant ortaya. İmmünperoksidaz leke T.cruzi amastigotes engoniablast gösterdi ve epididimit interstisyel ve döl farelerin seminiferous tüplerin lümen içine.
Chagas hastalığının 21 akut olguda protozoon parazitolojik gösteri tüm enfekte deneklerde T.cruzi ayak izi doğrulamak için çok önemliydi. Parazit antikor tahlilleri ve nükleik asit testlerinin oranları arasındaki tutarsızlıklar antikoriçermeyen hastalardaki ayak izlerinin çoğunu ortaya koymuştur. Geniş fark iyi tavuk modeli nde embriyo gelişiminin ilk haftasından sonra T.cruzi yansıyan açıklar.
Bağışıklık toleransı yetişkin tavuk parazit ayak izleri gösterdi ama belirli antikor yokluğu ile. Chagas hasta hayati anti-cruzi fare vajina içine aşılar üzerine yaygın enfeksiyonlar başladı ve yanı sıra periton boşluğuna boşalır. Patoloji kalp ve iskelet kasları ve vas deferens ve rahim tüpü T.cruzi amastigotgot yuvagösterdi.
Chagas farelerinin naif eşlerle üremesi, enfekte olmuş dişilerin ve erkeklerin T.cruzi'yi enfekte olmayan naif eşlere ilettiğini ve yavrularının çoğunun enfeksiyonu dikey olarak sile nital lere aktardığını ortaya çıkardı. Aile temelli protokol, güvenilir kan transfüzyonu ve epidemiyoloji araştırmaları yapmak ve devam eden cinsel yolla bulaşan Chagas hastalığını açıklamak için nükleik asit tahliline değindi.
