העבודה נתמך על ידי מענק של לוקמיה בבריטניה ETB ו MJA.

דגימות דם, התקבלו נושאים נורמליים (NS) (n = 12) כמו גם בחולים עם לימפומה אזור שוליים (MZL) (n = 7) ובסוגים אחרים של B-cell לימפומה שאינה הודג'קין של (BNHL) (פל 6 חולים, חולי לימפומה lymphoplasmacytic 2 ו 1 בדרגה נמוכה B-cell לימפומה הודג'קין לא צוין אחרת החולה). חולים גויסו מן המרפאות המטולוגיה-במרפאה המלכותית לסטר לאחר בנתינתו הודיעו, הסכמה בכתב, באישור אתית במקום עבור כל מחקרים. אישור מוסרי היה מתקבל על ידי לאיססטרשיר, נורת'האמפטונשייר ראטלנד מחקר אתיקה הוועדה 1, התייחסות 06/Q2501/122 רשות המחקר תקינות (HRA) NRES ועדת מזרח המידלנדס-הדרבי ודוגמאות החולה, הפניה 14/EM/1176 עבור נושאים נורמליים.
1. בידוד של CD4+ T-תאים מדם היקפי לגמרי
<ol><li>לקחת דם היקפיים טרי (2-15 מ"ל) K2EDTA צינורות מאת venipuncture רגיל ותהליך בהקדם האפשרי כדי לשמור על יכולת הקיום המרבי. הערה: לשימוש מעבדה סטנדרטיים ציוד מגן אישי (מעיל, כפפות, משקפיים) ולבצע את העבודה בכיתה II אבטחה הקבינט.</li>
	<li>להביא את הדם, ריאגנטים נחוץ כל (CD4+ העשרה קוקטייל, 2% עוברית שור סרום/פוספט buffered תמיסת מלח (FBS/PBS), מדיה הדרגתיות צפיפות ומקפיא בינונית אם cryopreserving תאים) לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לערבב את הדם עם קוקטייל זמינים מסחרית של נוגדנים עבור העשרת של CD4 האנושי+ תאי T. השתמש µL 50 מהתרכובת עבור כל 1 מ"ל של דם. השתמש צינור פוליפרופילן חרוט 50 מ ל 5-15 מ של דם. הערה: אם משתמש 2-4 מ"ל של דם, לבצע שלב זה צינור פוליפרופילן חרוט 14 מ.</li>
	<li>דגירה התערובת בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.</li>
	<li>לדלל את התערובת עם אמצעי אחסון שווה 2% FBS/PBS</li>
	<li>
שכבה זו תערובת מדולל על המדיה הדרגתי של צפיפות לאט כדי להימנע מהפרעה הממשק והמשך צנטריפוגה מיד כדי למנוע דיפוזיה של הדם לתוך המדיום הדרגתיות צפיפות.
	<ol>
<li>עבור 2-3 מ"ל של דם, להשתמש 3 מ"ל של צפיפות בינונית הדרגתיות צינור פוליפרופילן חרוט 14 מ"ל, אך עבור 4 מ"ל של דם, להשתמש 4 מ של צפיפות בינונית הדרגתיות צינור פוליפרופילן חרוט 14 מ"ל, 5-15 מ"ל דם , להשתמש 15 מ"ל של צפיפות בינונית הדרגתיות צינור פוליפרופילן חרוט 50 מ ל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifuge התערובת שכבתית עבור 20 דקות ב x 1200 גרם עם הבלמים ב 20 º C. הערה: טמפרטורה מתחת לממוצע עלול לגרום לזיהום עם כדוריות דם אדומות, גרנולוציטים. מהירות נמוכה יותר יגרום CD4 את+ בתהליך בידוד להיכשל. עוזב את הפסקה העוסקת יקטן תא התשואה. השתמש צנטריפוגה העליון ספסל עם רוטורים כי ניתן לסגור כדי להימנע אירוסולים.</li>
	<li>הסר את CD4 מועשר+ שכבת תאים מממשק באמצעות פיפטה של פסטר. הערה: השכבה תא מועשר ידמה תקן "המעיל באפי" של תאים לבנים מעוננים, אלא רק CD4+ תאים קיימים, זה כמובן יהיה קטן יותר, קשה יותר לראות.</li>
	<li>להוסיף 2% FBS/PBS כדי CD4+ תאים עד הנפח הכולל של 10 מ"ל, ואז לשטוף פעמיים עם 2% FBS/PBS מאת צריך שתוציאו 10 דקות ב x 400 גרם במהלך כל כביסה.</li>
	<li>Resuspend בגדר ב 2% FBS/PBS, ספירת התאים צבעונית עם צבע חיוני (trypan blue) כדי לקבוע את מספרי הטלפון הנייד ואת הכדאיות.</li>
	<li>שלב אופציונלי: resuspend 5 x 105 עונה 1 פרק 10 תאים6 קפואים בינוני (10% דימתיל סולפוקסיד ב FBS) aliquots 1 מ"ל. הערה: רמות של כמה סימונים משטח עשוי להשתנות על ידי שימור-הקפאה והפשרה. זה, לכן, חשוב מאוד כי כל דוגמאות מעובדות בצורה עיקבית. כדי למזער את הבדלי במשתני אנליטית, הדגימות היו הקפאה- משומרים אצווה עבור ניתוח במחקר זה.</li>
</ol>2. דנ
<ol><li>להפשיר את CD4 cryopreserved+ תאים במהירות בתוך אמבט מים 37 ° C ו לשטוף פעם בכמה מראש ומחוממת בינוניים (RPMI 1640 + -גלוטמין בתוספת 10% FBS ו 1 x פניצילין-סטרפטומיצין).</li>
	<li>להוסיף את התאים 9 מ של מדיום, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 400 x g ולהסיר את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend תאי 1% שור אלבומין (BSA) ב- PBS (50 µL) כך כל תנאי להיבדק משתמשת בין 5 x 105 עונה 1 פרק 106 תאים.</li>
	<li>מערבבים את התאים עם מאגר מכתים (50 µL). הערה: מאגר כתם מבריק מונע חפצי מכתימים שונות שעלולות לפגוע ניתוח נתונים כאשר שניים או יותר BV או שתקנה לעצמך כתמי משמשים בו זמנית עקב הטבועה את התכונות הכימיות של צבעים אלה. בתנאים יחיד או מוכתם, µL 50 כתם מבריק מאגר הרבה מכדי µL 50% 1 BSA/PBS.</li>
	<li>להוסיף את הנוגדנים לתאים (לפי "אחסון בו נעשה שימוש" טור ב טבלה 1), דגירה על קרח בחושך למשך 30 דקות.</li>
	<li>לשטוף את התאים פעמיים ב 1% BSA/PBS מאת צריך שתוציאו למשך 3 דקות ב x 600 גרם במהלך כל כביסה.</li>
	<li>Resuspend 1% BSA/PBS (400 µL), העברת צינור רכישה של cytometry זרימה.</li>
	<li>מערבולת התאים בעדינות לפני רכישת על cytometer זרימת נתונים:</li>
</ol>3. לזרום Cytometry פקדים והתקנה
<ol><li>באמצעות דוגמה וללא רבב, להגדיר את המתחים פוטודיודה כך לימפוציטים ניתן להפריד פסולת ברור, תאים מתים (אירועים עם צד גבוהה פיזור (האס) אזור ואזור פיזור קדמי נמוך (FSC))16. באמצעות דגימות מוכתם יחיד, להגדיר האופטיקה המתחים (PMT) כך פלורסצנטיות חיובי מבחינים מן הרקע פלורסצנטיות תוך הקפדה כי כל האירועים למניית בסולם לזיהוי. הערה: שיפור יהיה מגרש של קורות חיים נגד מתח PMT בכל PMT באמצעות חרוזים במעומעם פלורסנט כדי למצוא את המתח המינימלי לפתרון האופטימלי ("שיא 2" שיטת19).</li>
	<li>חשבון עבור ספקטרלי חפיפה על ידי יצירת מטריצה פיצוי באמצעות כתמים יחיד עם לכידת חרוזים. להוסיף חרוזים פיצוי זמינים מסחרית (60 µL), וחרוזים בקרה שלילית (60 µL) 1% BSA/PBS (100 µL), ו מערבולת. הערה: החרוזים ללכוד להשתמש להתאים את המארח מינים ו IgG isotype של הנוגדן בשימוש. המטריקס הפיצוי צריך להיות מחושב מחדש אם המספר הרבה של כל טנדם צבענים שינויים, כפי הם יכולים להציג את השתנות ניכר ב ספקטרום הפליטה שלהם בין מגרשים.</li>
	<li>להוסיף נוגדן בודד (20 µL) ו מערבולת.</li>
	<li>דגירה בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה ב x 200 גר' 10 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend, 1%BSA/PBS (500 µL) ו מערבולת.</li>
	<li>רוכשים את הדגימה עם cytometer זרימה באמצעות הגנרטור מטריקס פיצוי המיועד לכך בתוכנה רכישה בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>השתמש בפקדים FMO להנחות את המיקום של השערים עבור קרינה פלואורסצנטית סמן חיובי עבור לשפוך צבע, אשר הוא המקור העיקרי של רקע זריחה בניסויים באמצעות צבעים ≥416. בצע ההכתמה תא-פני כללי הפרוטוקול כפי שמתואר בשלב 3, אבל עבור כל תנאי, להשמיט אחד fluorophores מהשלב מכתימים (היכן CD45RA מושמט, גם להשמיט את הכתם חי/מת). רוכשים לימפוציטים 100,000 עבור כל תנאי.</li>
	<li>להגדיר את הגישה החיובית שער ב- % ≤0.5 של תאים. ראה איור 2 לדוגמא מאויר של פקדים FMO.</li>
</ol>4. ניתוח נתונים
<ol><li>מעסיקים רכישת תוכנה של cytometer זרימה כדי לקבוע סף של 5,000 יחידות על הפרמטר FSC להוציא פסולת קטן מאוד.</li>
	<li>השתמש שער עוצר כדי להשיג 10,000 תאים cTfh (CD4+ CD45RA– CXCR5+). הערה: המשתמש הבודד יכול לאסוף יותר מ-10,000 תאי. מספר זה היה פשרה בין איסוף מספיק תאים לספק תוצאה משמעותית את משך הזמן לאוסף.</li>
	<li>באמצעות FSC-אזור / מגרש נקודה האס-אזור, לצייר דרך שער אליפסה או מצולע כדי לבחור את אוכלוסיית לימפוציטים בזמן למעט פסולת, בגלוי מת תאים (אירועים עם האס גבוהה-אזור ואזור נמוך FSC-).</li>
	<li>באמצעות FSC-אזור FSC ברוחב נקודה העלילה, צייר מצולע שער כדי לבחור תאים בודדים שיתופם של doublets (doublets יש אזור מוגברת אבל רוחב דומים לתאים בודדים).</li>
	<li>באמצעות FSC-אזור / סמן CD45RA ואת הכדאיות לנקד העלילה, לצייר שער מלבני כדי לבחור לחיות, CD45RA תאים– (תאים עם פלורסצנטיות נמוך עבור סמן זה).</li>
	<li>באמצעות FSC-אזור / CD4 לנקד העלילה, לצייר שער מלבני לבחירת CD4+ תאים (תאים עם פלורסצנטיות גבוהה עבור סמן זה).</li>
	<li>שימוש של CD4 / CXCR5 נקודה העלילה, לצייר שער מלבני לבחירת CXCR5+ (קרי cTfh) תאים (תאים עם פלורסצנטיות גבוהה עבור סמן זה).</li>
	<li>באמצעות CXCR3 של CCR6 נקודה העלילה, לפני ארבע ליבות שער משנית cTfh תאים לתוך cTfh1, תאים 2 ו- 17 (תאים שנמצאים גבוה ונמוך עבור כל סמן). הערה: תאים בעלי פנוטיפ CD4+ CXCR5+ CXCR3+ CCR6+ הן מאופיינות היטב. אנחנו מתייחסים לתאים אלו cTfh1/1718 כי המסייע קונבנציונאלי תאי-T (CD4+ CXCR5–) זה עושים מעבר מיגדרי בין Th17 ו- Th1 הצג ביטוי של CXCR3 CCR6, תוארו cTfh1/1719.</li>
	<li>באמצעות היסטוגרמה PD-1, השתמש בכלי טווח משנית תאים cTfh (או אם מועדף, cTfh1 בודדים, קבוצות משנה 2, 17 או 1/17) לתוך PD-1-/ + או אוכלוסיות שלום . הערה: ההבחנה בין PD-1+ ו- PD-1היי אינה מוגדרת היטב בספרות. הסף נקבע כמו באותה אינטנסיביות PD-1 הדרוש לאיתור תמת-Tfh ב השעיות לימפוציט שקדים האנושי באמצעות cytometry זרימה עם נוגדן באותו הפאנל. לחלופין, ניתן להוסיף סמן ICOS ללוח נוגדן, כפי PD1שלום תאים ICOS+.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+Helper+T+Cells.">Follicular Helper T Cells.</a> Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).</li><li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl6+Mediates+the+Development+of+T+Follicular+Helper+Cells.">Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li><li>Breitfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+B+Helper+T+Cells+Express+Cxc+Chemokine+Receptor+5,+Localize+to+B+Cell+Follicles,+and+Support+Immunoglobulin+Production.">Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192 (11), 1545-1552 (2000).</li><li>Linterman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+helper+T+cells+are+required+for+systemic+autoimmunity.">Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 561-576 (2009).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Dynamics+of+Intratumoral+Immune+Cells+Reveal+the+Immune+Landscape+in+Human+Cancer.">Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer.</a> Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).</li><li>Gu-Trantien, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++follicular+helper+T+cell+infiltration+predicts+breast+cancer+survival.">CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 2873-2892 (2013).</li><li>Am&#233;-Thomas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intratumoral+follicular+helper+T+cells+in+follicular+lymphoma:+role+in+the+survival+of+malignant+B+cells.">Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells.</a> Leukemia. 26 (5), 1053-1063 (2012).</li><li>Bossaller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICOS+Deficiency+Is+Associated+with+a+Severe+Reduction+of+CXCR5+CD4+Germinal+Center+Th+Cells.">ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells.</a> The Journal of Immunology. 177 (7), 4927-4932 (2006).</li><li>Morita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Blood+CXCR5+CD4++T+Cells+Are+Counterparts+of+T+Follicular+Cells+and+Contain+Specific+Subsets+that+Differentially+Support+Antibody+Secretion.">Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion.</a> Immunity. 34 (1), 108-121 (2011).</li><li>Locci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+circulating+PD-1+CXCR3-CXCR5++memory+Tfh+cells+are+highly+functional+and+correlate+with+broadly+neutralizing+HIV+antibody+responses.">Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses.</a> Immunity. 39 (4), 758-769 (2013).</li><li>He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Precursor+CCR7loPD-1hi+CXCR5++CD4++T+Cells+Indicate+Tfh+Cell+Activity+and+Promote+Antibody+Responses+upon+Antigen+Reexposure.">Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure.</a> Immunity. 39 (4), 770-781 (2013).</li><li>Schmitt, N., Bentebibel, S. -. E., Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotype+and+functions+of+memory+Tfh+cells+in+human+blood.">Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood.</a> Trends in Immunology. 35 (9), 436-442 (2014).</li><li>Simpson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+circulating+T+cells+resembling+follicular+helper+T+cells+is+a+fixed+phenotype+that+identifies+a+subset+of+severe+systemic+lupus+erythematosus.">Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis and Rheumatism. 62 (1), 234-244 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequencies+of+activated+B+cells+and+T+follicular+helper+cells+are+correlated+with+disease+activity+in+patients+with+new-onset+rheumatoid+arthritis.">High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 174 (2), 212-220 (2013).</li><li>Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Circulating+T+Follicular+Helper+Cell+Subsets+in+Health+and+Disease.">Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease.</a> Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).</li><li>Maecker Holden, T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Function+of+CD4++T+Follicular+Helper+(Tfh)+Cells+Associated+with+Hepatocellular+Carcinoma+Progression.">Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression.</a> PLOS ONE. 10 (2), 0117458 (2015).</li><li>Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Tfh1+(cTfh1)+cell+numbers+and+PD1+expression+are+elevated+in+low-grade+B-cell+non-Hodgkin's+lymphoma+and+cTfh+gene+expression+is+perturbed+in+marginal+zone+lymphoma.">Circulating Tfh1 (cTfh1) cell numbers and PD1 expression are elevated in low-grade B-cell non-Hodgkin's lymphoma and cTfh gene expression is perturbed in marginal zone lymphoma.</a> PLOS ONE. 13 (1), 0190468 (2018).</li><li>Annunziato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+features+of+human+Th17+cells.">Phenotypic and functional features of human Th17 cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (8), 1849-1861 (2007).</li><li>Duan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotype+and+function+of+CXCR5+CD45RA-CD4++T+cells+were+altered+in+HBV-related+hepatocellular+carcinoma+and+elevated+serum+CXCL13+predicted+better+prognosis.">Phenotype and function of CXCR5+CD45RA-CD4+ T cells were altered in HBV-related hepatocellular carcinoma and elevated serum CXCL13 predicted better prognosis.</a> Oncotarget. 6 (42), 44239-44253 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+CXCR5+CD4+helper+T+cells+in+systemic+lupus+erythematosus+patients+share+phenotypic+properties+with+germinal+center+follicular+helper+T+cells+and+promote+antibody+production.">Circulating CXCR5+CD4+helper T cells in systemic lupus erythematosus patients share phenotypic properties with germinal center follicular helper T cells and promote antibody production.</a> Lupus. 24 (9), 909-917 (2015).</li><li>Sage, P. T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+PD-1+controls+follicular+regulatory+T+cells+in+the+lymph+nodes+and+blood.">The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood.</a> Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).</li><li>Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+T+follicular+regulatory+and+helper+cells+have+memory-like+properties.">Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).</li><li>Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+TFH+Cell+Function+and+Increased+TFR+Cells+Contribute+to+Defective+Antibody+Production+in+Aging.">Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging.</a> Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).</li><li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25+CD127low/-+T+Cells:+A+More+Specific+Treg+Population+in+Human+Peripheral+Blood.">CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood.</a> Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מייצג דרך פשוטה ויעילה כדי לנתח את היקפי cTfh כדוריות הדם, המאפשר הזיהוי של כל קבוצות משנה רלוונטיים שזוהו עד כה בספרות. דגימות דם ניתן בקלות וביעילות להשיג כפי ניתן לאסוף חלק סטנדרטי-חולה מרפאות ודוגמאות טורי במקביל נתונים קליניים. בתורו, פעולה זו מאפשרת מחקרים להערכת ערכות משנ?...

T-helper תאי (Tfh) הם CD4+ משנה T-cell שאפיינו היה בתחילה רקמות הלימפה1. תאים אלה מביעים PD-1 קולטנים משטח CXCR5, מפרישים IL-21 ו- IL-4 ולהראות ביטוי הגרעין של הגורם שעתוק, BCL-62,3. כפי שמרמז שמם, הם נמצאים במרכזים נבטי, הם חיוניים עבור ייצור נוגדנים זיקה גבוהה1.
תגובות Dysregulated Tfh היו מעורבים בפתוגנזה מחלה, מחלות אוטואימוניות שהבולט, איפה הם מקדמים את התרחבות autoreactive B תאים4. הם גם לשחק תפקיד microenvironment הגידול של סרטן הלימפה7והן מוצק5,6 . לעומת זאת, פגמים גנטיים של חלבונים פני שטח חיוני Tfh לתפקד כמו התוצאה costimulator (ICOS) T-cell inducible הכשל החיסוני האנושי תסמונות8. CD4+ CXCR5+ בתאי דם היקפיים אדם מכונים במחזור T-helper תאי (cTfh), מאמינים כי תא זיכרון Tfh תאים ברקמות9. מטרת השיטה המתוארת כאן היא הניתוח של קבוצות משנה cTfh בעקבות CD4+ תא בידוד של דגימות דם היקפיים.
מספר קבוצות משנה cTfh הוגדרו, היעילות שבה הם מספקים עזרה B-cell שונה משנה אחת עוד9,10,11,12. כמויות יחסיות של קבוצות משנה אלה שונו במספר מחלות, לרוב בצורה בולטת מחלות אוטואימוניות שבו שם הוא כמעט תמיד עלייה יחסית יותר פונקציונלי PD-1/ היי ו/או קבוצות משנה cTfh2 או cTfh17, לעומת הפחות משטרת פונקציונלי-– 1 ו/או קבוצות משנה cTfh112. היקף השינויים הללו לעתים קרובות לשייך פרמטרים קליניים, כולל מחלת titers פעילות של נוגדן עצמי, המעידים על תפקיד אפשרי של התפלגות משנה cTfh כמו סמן prognostic במחלה, אשר עשוי לשקף את הפעילות של Tfh ב רקמות הלימפה9,12,13,14. בנוסף, לקחת דגימות דם המשתתפים זו קביל, מהירה ובטוחה, ומאפשר אז טורי ניטור לניתוח של התקדמות המחלה או תגובה לטיפול.
השימוש של CD4 מבודד+ תאי-T על המתלים תאי תא (PBMNC) המסורתית דם היקפיים מאפשר גבוה יותר תפוקה לזרום cytometry ניסויים על-ידי צמצום הזמן הנדרש כדי לרכוש מספר ניכר של תאים cTfh לניתוח. אפשרות זו שימושית במיוחד בעת מיון תאים cTfh נדיר קבוצות משנה באמצעות זרימת הפעלת התא מיון (FACS). לסייע את היעילות, תרחיפים אלה יכול להיות cryopreserved כדי לאפשר "אצווה" של דגימות ייעשה הניסוי cytometry זרימה. על בדיקות, CD4 את+ טוהר לא נוכה הקפאה קריוגנית.
בעוד מעבדות שונות נעשה שימוש סמנים שונים כדי סיווג חלוקה לקטגוריות cTfh תאים בשלבים המוקדמים של גילוין, השיטה המוצגת כאן עושה שימוש ערכה אחידה של שתי קבוצות של תאים-פני סמני כפי שהוצע על ידי שמידט ואח12, 15 כדי לאפשר זיהוי סימולטני cTfh ו שלהם קבוצות משנה מוכרת תשע ב cytometry זרימה יחיד הניסוי.
היחידה סמני פני שטח התא משמשים, התאים אינם מצריכים קיבוע או permeabilization, ולכן יכול להישאר בחיים ללימודי פונקציונלי במורד הזרם. זה יכול להיות בהנחייתם של התא מיון באמצעות FACS באותו פאנל נוגדן. לוח זה יכול להיות מורחבת לכלול סמנים אחרים, ומאפשר ההגבלות של cytometer זרימת בשימוש.
הניתוח של ניסויים cytometry זרימה צבע רב יכול להיות מאתגר בשל אופיו מטבעם סובייקטיביות של gating על נקודה 2-ממדי חלקות, במיוחד כאשר אוכלוסיות תאים שאין התפלגות ברורה bi-מודאלי סמן פלורסצנטיות, כמו גם במקרה של תאים cTfh, קבוצות משנה שלהם. מסיבה זו, זה הכרחי כדי להגדיר את הפקדים יעיל כדי להפחית את חפצי אמנות כדי לאפשר רזולוציה טובה יותר של אוכלוסיות וכדי להגדיר gating אסטרטגיות בביטחון. ככזה, עיצוב לוח נוגדן, את הסידור של פקדים בסיסיים עבור cytometry זרימה הניסוי, קרי, באמצעות פיצוי, FMO הפקדים יוקפו בקו שלב 3.4.2 ועל 3.4.3,respectively.
כל התאים cTfh מוגדרים CD4+ CXCR5+ CD45RA–. ניתן לקבוע את רמת הביטוי של דה מרקר הפעלה האופיינית Tfh PD-1 ואז לזהות תת-קבוצות של PD-1-, PD-1+ או PD-1היי cTfh תאים. לאחר מכן, באמצעות שילוב של קולטני כימוקין CXCR3 ו CCR6, אשר מתבטאים באופן שונה על ידי Th1 מסורתיים, 2 או 17 תאים, cTfh שניתן לאפיין cTfh1, 2 או דמוי-17 על ידי פרופיל של CXCR3+ CCR6-, CXCR3– CCR6- , ו CXCR3– CCR6+, בהתאמה.
לוח הנוגדן בשימוש על ידי המעבדה שלנו מוצג בטבלה1. המשתמש, ייתכן שיהיה עליך להתאים את הבחירה שלהם fluorophore לקחת בחשבון הלייזר ואת תצורת המסנן קלות זמינים על cytometer זרימה המקומי שלהם.
השיקולים הבאים להשפיע על בחירתו של fluorophores. השתמש fluorophores בהיר במידת האפשר. בפרט, להשתמש fluorophores זמין המבריקים של הסמנים (ביטוי פחות מאוד) dimmest. סמני דימר כוללים PD-1, CXCR3, CCR6, וכדי במידה פחותה CXCR5. אנחנו ספציפית הפך השימוש החדשים BB, BV, שתקנה לעצמך fluorophores אשר לספק בהירות מצוינת, ובכך לאפשר פתרון קל יותר של אוכלוסיות שונות של תאי.
מורחים את הבחירה fluorophore על פני ספקטרום פליטה ככל האפשר למזער חפיפה ספקטרלי וכך רמת הפיצוי הנדרש. כלי מקוון חינם, ניתן להשתמש כדי לסייע בתכנון לוח cytometry זרימה ניתן למצוא כאן: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. כדי לחסוך מקום על ספקטרום הפליטה, אנחנו מועסקים "ערוץ ה-dump" באמצעות צבע הכדאיות עם אורך גל פליטה החופפים עם זה של APC-H7 (מצומדת כדי CD45RA) כדי לאפשר את איתור (להדרה) של שניהם מתים ו/או CD45RA+ שימוש גלאי יחיד.
. הנה, פרוטוקול מוצג הבידוד של דם היקפיים CD4+ תאי-T וניתוח עוקבות שלהם על-ידי cytometry זרימה כדי לקבוע את הפרופורציות של שונות, תיאר לאחרונה במחזור קבוצות משנה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1037px;" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail</td>
			<td style="width:179px;">STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td style="width:119px;">15062</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BUV395 Mouse Anti-Human CD183&#160;Clone 1C6/CXCR3</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>565223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6)&#160;Clone 11A9</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>563923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185)&#160;Clone&#160;RF8B2</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>562747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BB515 Mouse Anti-Human CD4&#160;Clone &#160;RPA-T4</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>564419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">PE Mouse Anti-Human CD279&#160;Clone MIH4</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen</td>
			<td>557946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone&#160; HI100</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen</td>
			<td>560674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L34973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Brilliant Stain Buffer</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td style="width:179px;">BD CompBead</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FACS Aria II Flow Cytometer</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FACSDiva 6.1.3</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td>643629</td>
			<td>Flow Cytometer Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FlowJo 10.2</td>
			<td style="width:179px;">Treestar Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flow Cytometry Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CXCR3 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">565223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CCR6 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">563923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CXCR5 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">562747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CD4 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">564419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-PD-1 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">557946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CD45RA antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">560674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Viability Marker</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L34973</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cd4+ t-cells and analysis of circulating t-follicular helper (ctfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry

חריגה הזקיקים-T helper (Tfh) תא לזיהוי של מחלות אוטואימוניות ולא נוכחותם קשורה עם התוצאות הקליניות כאשר הצומת לימפה microenvironment ב B-cell לימפומה שאינה הודג'קין של ניתוח. קבוצות משנה של מחזורי T-helper תאי (cTfh), תא זיכרון מחזורי Tfh תאים בדם, הם גם מוטרד במחלה, לפיכך מייצגות פוטנציאל סמנים ביולוגיים חזוי הרומן. בדיקות מבוססות-דם היקפיים היא יתרון כי היא יחסית לא פולשנית, מאפשר ניטור טורי פשוטה. מאמר זה מתאר שיטה אנליטית CD4+ תאי T-דם אנושי, ולאחר ניתוח נוסף מאת cytometry זרימה לספור תאים cTfh, את הפרופורציות של קבוצות משנה שונים שלהם (cTfhPD-1-/ + / שלום, cTfh1, 2, 17 ו- cTfh1/17). הרמה של קבוצות משנה אלה השוו בין נושאים נורמליים, חולים עם לימפומה. מצאנו כי שיטת הפעולה היתה יציבה מספיק כדי להשיג תוצאות אמינות של החומר המטופל שנאספו באופן שגרתי. הטכניקה שנתאר לניתוח ניתן להתאים בקלות מיון תא ויישומים במורד הזרם כגון RT-PCR.

CD4 גבוהה+ טוהר הושג באמצעות CD4 את+ בידוד פרוטוקול, אשר היה אמין בכל הדוגמאות הדם נבדק על ידינו (כלומר: 96.6%, SD: 2.38, n = 31) (איור 3).
זיהוי של cTfh (CD4+ CXCR5+ תאים) בנושא נורמלי נציג מוצג (איור 4א</...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry at JoVE.com

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

. הנה, עבור בידוד ואפיון של CD4 פרוטוקול+ T-cell קבוצות משנה של דם היקפיים אדם מתואר. לטהר CD4+ תאי-T הם נותחו על ידי cytometry זרימה כדי לקבוע את הפרופורציות של T-הזקיקים תא מסייע קבוצות משנה.

בידוד של CD4+ תאי-T וניתוח של מחזורי Helper T-הזקיקים (cTfh) קבוצות משנה תא מ באמצעות דם היקפיים של Cytometry זרימה 6-צבע

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

שיטה זו יכולה לעזור להדגים את ההבדלים בין מחזור T-follicular עוזר תאים subsets במצבים בריאים וחלים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שזה מהיר, כי הדגימות ניתן לעבד אצווה, כי התאים להישאר בחיים לניתוח פונקציונלי במורד הזרם. טכניקה זו מקלה על ההערכה של מחזור T-follicular עוזר subsets כמו סמנים ביולוגיים להתקדמות המחלה כפי שהם בקורלציה עם סמנים של חומרה קלינית. עוזר עם ההדגמה של הליך זה יהיה ד"ר לוסיה Pi

isolation-cd4-t-cells-analysis-circulating-t-follicular-helper-ctfh

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

12.0K Views.  University of Leicester. שיטה זו יכולה לעזור להדגים את ההבדלים בין מחזור T-follicular עוזר תאים subsets במצבים בריאים וחלים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שזה מהיר, כי הדגימות ניתן לעבד אצווה, כי התאים להישאר בחיים לניתוח פונקציונלי במורד הזרם. טכניקה זו מקלה על ההערכה של מחזור T-follicular עוזר subsets כמו סמנים ...

Video: Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

בידוד של תאים מסוג CD4 + T מ בלוטות לימפה עכבר באמצעות טיהור Miltenyi MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

בידוד ואפיון של Microvesicles מן הדם היקפי

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

מדידה רגיש של Mitophagy מאת Flow Cytometry באמצעות תלויי-pH הכתב פלורסנט mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

מדידת מיסת מיטוכונדריאלי ופוטנציאל ממברנה בתאי גזע ותאי T-תאים על ידי זרימה Cy,

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and extremely large cell (40-60 &#181;m). As opposed to the fast-increasing knowledge in megakaryopoiesis at the cell biology and molecular level, the characterization of megakaryopoiesis by flow cytometry is limited to the identification of mature MKs using lineage-specific surface markers, while earlier MK differentiation stages remain unexplored. Here, we present an immunophenotyping strategy that allows the identification of successive MK differentiation stages, with increasing ploidy status, in human primary sources or in vitro cultures with a panel integrating MK specific and non-specific surface markers. Despite its size and fragility, MKs can be immunophenotyped using the above-mentioned panel and enriched by fluorescence-activated cell sorting under specific conditions of pressure and nozzle diameter. This approach facilitates multi-Omics studies, with the aim to better understand the complexity of megakaryopoiesis and platelet production in humans. A better characterization of megakaryopoiesis may pose fundamental in the diagnosis or prognosis of lineage-related pathologies and malignancy.

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Here, we present an immunophenotyping strategy for the characterization of megakaryocyte differentiation, and show how that strategy allows the sorting of megakaryocytes at different stages with a fluorescence-activated cell sorter. The methodology can be applied to human primary tissues, but also to megakaryocytes generated in culture in vitro.