İş lösemi UK hibe ETB ve MJA tarafından desteklenmiştir.

Kan örnekleri normal bir konu (NS) elde (n = 12) yanı sıra marjinal zon Lenfoma (MZL) olan hastalar (n = 7) ve B hücreli non-Hodgkin Lenfoma (BNHL) (6 FL hastalar, 2 lymphoplasmacytic lenfoma hastaları ve 1 düşük dereceli B-hücre diğer türleri Non-Hodgkin's lenfoma değil Aksi takdirde hasta belirtilen). Sonra verilen bilgili, tüm çalışmaları için yerinde etik onayı ile yazılı izni hastalar Leicester Royal revir, Hematoloji Kliniği gelen işe. Etik onay Leicestershire, Northamptonshire ve Rutland Araştırma Etik Komitesi 1 ' başvuru 06/Q2501/122 hasta örnekleri ve sağlık araştırma yetkilisi (HRA) NRES Komitesi East Midlands-Derby tarafından elde edildi, 14/EM/1176 için referans normal konular.
1. yalıtım CD4+ T-tüm ikincil kan hücrelerinden
<ol><li>Taze kan periferik (2-15 mL) K2EDTA tüpler içine almak standart iz ve en kısa zamanda en büyük canlılık korumak için işlem. Not: Standart laboratuvar kişisel koruyucu ekipman (ceket, eldiven, gözlük) kullanın ve bir sınıf II Biyogüvenlik kabini çalışmalarında yürütmek.</li>
	<li>Kan ve tüm gerekli kimyasalları getirmek (CD4+ zenginleştirme kokteyl, % 2 fetal Sığır serum/tamponlanmış fosfat serum (FBS/PBS), yoğunluğu degrade medya ve hücreleri cryopreserving Eğer donma orta) Oda sıcaklığında için.</li>
	<li>Mix kan antikorlar insan CD4 zenginleştirme için piyasada bulunan bir kokteyl ile+ T hücreleri. Reaktif 50 µL kan her 1 mL-için kullanın. 50 mL konik polipropilen boru için 5 ila 15 mL kan kullanın. Not: 2-4 mL kan kullanıyorsanız, bu adımı bir 14 mL konik Polipropilen tüp içinde gerçekleştirin.</li>
	<li>Karışımı, oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Karışımı eşit bir birimdeki % 2 oranında seyreltin FBS/PBS</li>
	<li>
Yavaş yavaş arabirimi rahatsız edici önlemek ve hemen yoğunluk gradient orta içine kan difüzyon önlemek için Santrifüjü geçin yoğunluğu degrade medya üstüne seyreltilmiş bu karışımı katman.
	<ol>
<li>2-3 mL kan yoğunluk gradient orta 3 mL 14 mL konik polipropilen boru, ancak 4 mL kan kullanımının, yoğunluk gradient orta 4 mL 14 mL konik polipropilen boru ve 5-15 mL kan için kullanın , yoğunluk gradient orta 15 mL 50 mL konik polipropilen boru içinde kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1200 x g de 20 dk için katmanlı karışımı ile fren off 20 ° C'de santrifüj kapasitesi Not: Altındaki ortam sıcaklık kırmızı kan hücreleri ve granülosit ile kirlenme neden olabilir. Daha düşük bir hız CD4 neden olur+ yalıtım işleminin başarısız olmasına. Nişanlı sonu bırakarak hücre verim azalır. Bir tezgah üst santrifüj aerosoller önlemek için kapalı rotorlar ile kullanın.</li>
	<li>Zenginleştirilmiş CD4 kaldırmak+ hücre katmanı Pasteur pipet kullanarak arabirim üzerinden. Not: Zenginleştirilmiş hücre katmanı bir standart "buffy kat" beyaz bulutlu hücre ama sadece CD4 olarak benzer+ hücreleri mevcut, bu doğal olarak daha küçük ve daha zor görmek için olacak.</li>
	<li>% 2 eklemek FBS / CD4 PBS'ye+ hücreleri toplam hacmi 10 mL ve % 2 ile iki kez daha sonra yıkama kadar 10 dk 400 x g de her yıkama sırasında centrifuging tarafından FBS/PBS.</li>
	<li>Pelet % 2 resuspend FBS/PBS ve sayısı hücreleri hücre sayıları ve canlılığı belirlemek için bir hayati boya ile (trypan mavi) lekeli.</li>
	<li>İsteğe bağlı adım: 5 x 105 1 mL aliquots (FBS % 10 dimetil sülfoksit) ortamda dondurma 1 x 106 hücrelere resuspend. Not: Düzeyleri bazı yüzey işaretlerinin cryo-koruma ve çözme tarafından değişmiş olabilir. Bu nedenle, olan çok önemli tüm örneklerini sürekli olarak işlenir. Analitik değişkenleri farklılıkları en aza indirmek için örnekleri cryo korunmuş ve analiz bu çalışmada için toplanmış.</li>
</ol>2. akış sitometresi
<ol><li>Cryopreserved CD4 çözülme+ hücreleri hızlı bir şekilde 37 ° C ve yıkama bir kez içinde önceden ısıtılmış orta (RPMI 1640 + L-glutamin %10 FBS ve 1 x penisilin-streptomisin) adlı bir su banyosunda.</li>
	<li>Orta, santrifüj 400 x g de 5 min için 9 mL hücreleri eklemek ve süpernatant kaldırın.</li>
	<li>PBS içinde % 1 sığır serum albümin (BSA) hücrelerde resuspend (50 µL) her koşulu test edilmesi için kullanır, böylece 5 x 105 ve 1 x 106 hücreler arasında.</li>
	<li>Hücreleri boyama arabellek ile karıştırın (50 µL). Not: İki veya daha fazla BV veya BUV lekeleri bu boyalar doğal kimyasal özellikleri sayesinde aynı anda kullanıldığında bu veri analizi ile girişime neden olabilir çeşitli boyama eserler parlak leke arabellek engel olur. Tek veya günahı koşullarda parlak leke arabellek 50 µL % 1 50 µL için yedek olabilir BSA/PBS.</li>
	<li>Antikorlar hücreleri (göre "kullanılan birim" sütun içinde tablo 1) ekleyin ve buz 30 dk için karanlıkta kuluçkaya.</li>
	<li>% 1'i iki kez hücrelerde yıkamak için 600 x g de 3 dk her yıkama sırasında centrifuging tarafından BSA/PBS.</li>
	<li>% 1'resuspend BSA/PBS (400 µL) ve bir akış sitometresi edinme tüp aktarmak.</li>
	<li>Girdap yavaşça bir akış sitometresi verileri alınıyor önce hücreleri:</li>
</ol>3. akış sitometresi denetimleri ve kurulum
<ol><li>Günahı bir örnek kullanarak, fotodiyot gerilimleri lenfositler bariz enkaz ve ölü hücreleri (yüksek dağılım (SSC) ve düşük ileri dağılım (FSC) alan olayları)16ayrılmış şekilde ayarlayın. Pozitif floresans gelen tüm olayların içinde tespit ölçekli Güz emin yaparken arka plan floresans ayırt edilebilir tek kullanarak örnekleri, lekeli photomultiplier (PMT) gerilimleri ayarlayın. Not: En düşük voltaj optimum çözünürlük ("Zirve 2" yöntemi19) bulmak için loş floresan boncuk kullanarak her Devresel_ödeme için Devresel_ödeme gerilim karşı CV çizilecek bir gelişme olur.</li>
	<li>Hesap yakalama boncuk ile tek lekeler kullanarak tazminat matris oluşturarak spektral örtüşme. Piyasada bulunan tazminat boncuk (60 µL) ve negatif kontrol boncuk (60 µL) % 1'e Ekle BSA/PBS (100 µL) ve girdap. Not: Kullanılan yakalama boncuk ana türler ve kullanılan antikor IgG izotip eşleşmesi gerekir. Herhangi bir tandem çok sayıda değişiklikleri, boya Eğer onlar kendi emisyon spectra arasında çok önemli ölçüde değişkenlik görüntüleyebilirsiniz tazminat matris yeniden hesaplanan olmalı.</li>
	<li>Bir tek antikor (20 µL) ve girdap ekleyin.</li>
	<li>30 dk için karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Vasıl 200 x g 10 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>1%BSA/PBS içinde resuspend (500 µL) ve girdap.</li>
	<li>Örnek bir akış sitometresi edinme yazılım üretici yönergelerine göre belirlenen tazminat matris jeneratör kullanarak elde.</li>
	<li>Arka plan floresans deneylerde ≥4 Renkler16kullanarak ana kaynağı olan, boya dökülür hesaba olumlu işaret floresans geçitlerini yerleştirme kılavuzunu FMO denetimleri kullan. Adım 3'deki ama her koşul için açıklandığı gibi protokol genel hücre yüzey boyama takip atlayın bir boyama adım fluorophores (CD45RA atlanmış yerde, aynı zamanda canlı/ölü leke atın). Her koşul için 100.000 lenfositler elde etmek.</li>
	<li>Kapı pozitif hücrelerinin ≤0.5% ayarlamak. Şekil 2 resimli FMO denetimleri örneği için bkz.</li>
</ol>4. veri analizi
<ol><li>Akış Sitometresi'nın satın alma yazılım bir eşik 5000 Birim çok küçük enkaz dışlamak için FSC parametresini ayarlamak için kullanır.</li>
	<li>10.000 cTfh hücreleri elde etmek için bir durdurma kapı kullanmak (CD4+ CD45RA- CXCR5+). Not: Bireysel kullanıcı 10.000'den fazla hücreleri toplar. Bu numara anlamlı sonuçlar ve koleksiyon için geçen süre sağlamak için yeterince hücre toplama arasında bir uzlaşma oldu.</li>
	<li>FSC alanõ kullanarak / SSC-alan nokta arsa, enkaz hariç ederken lenfositler nüfusu seçmek için bir elips veya Çokgen kapı çizmek ve açıktan açığa ölü hücreleri (olayları bir yüksek SSC-alanı ve düşük FSC-alan).</li>
	<li>FSC alanõ kullanarak / FSC-genişlik nokta arsa, Çiz Çokgen bir kapı ise (birini var ama benzer genişliği artan bir alan tek hücrelere) birini hariç tek hücreleri seçmek için.</li>
	<li>FSC alanõ kullanarak / CD45RA ve canlılığı marker nokta arsa, canlı, CD45RA seçmek için dikdörtgen bir kapı çizmek- hücreleri (Bu işaretçi için düşük bir floresan hücreleri).</li>
	<li>FSC alanõ kullanarak / CD4 nokta arsa, CD4 seçmek için dikdörtgen bir kapı çizmek+ hücreleri (Bu işaretçi için yüksek bir floresan hücreleri).</li>
	<li>Bir CD4 kullanarak / CXCR5 nokta arsa, CXCR5 seçmek için dikdörtgen bir kapı çizmek+ (yani cTfh) hücreleri (Bu işaretçi için yüksek bir floresan hücreleri).</li>
	<li>Bir CXCR3 kullanarak / CCR6 nokta arsa, dört bir kapı cTfh hücre cTfh1, daha alt bölümlere ayırma 2 ve 17 hücreler (her işaretçisi için yüksek ve düşük olan hücreleri). Not: Hücreleri CD4 fenotip ile+ CXCR5+ CXCR3+ CCR6+ ile karakterize olan kötü. Biz çünkü cTfh1/1718 bu hücrelere başvuran geleneksel yardımcı T hücreleri (CD4+ CXCR5-) bu CXCR3 Th1 ve Th17 Haritayı ifade ve CCR6 arasında geçiş ve cTfh1/1719tarif edilmiştir.</li>
	<li>PD-1 çubuk grafik kullanarak cTfh hücreleri daha alt bölümlere ayırma aralığı aracı kullanmak (veya tercih edilen, bireysel cTfh1 2, 17 veya 1/17 alt kümeleri) PD-1 içine-/ + veya Merhaba nüfus. Not: PD-1+ ve PD-1Merhaba arasında ayrım literatürde iyi tanımlanmış değildir. Eşik bona fide Tfh akış sitometresi ile aynı antikor panelini kullanarak tonsil insan lenfosit süspansiyonlar algılamak için gereken aynı PD-1 yoğunluk olarak kuruldu. Alternatif olarak, yalnızca PD1Merhaba hücreleri ICOS+olduğu gibi ICOS için bir işaretleyici antikor paneline eklenebilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+Helper+T+Cells.">Follicular Helper T Cells.</a> Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).</li><li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl6+Mediates+the+Development+of+T+Follicular+Helper+Cells.">Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li><li>Breitfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+B+Helper+T+Cells+Express+Cxc+Chemokine+Receptor+5,+Localize+to+B+Cell+Follicles,+and+Support+Immunoglobulin+Production.">Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192 (11), 1545-1552 (2000).</li><li>Linterman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+helper+T+cells+are+required+for+systemic+autoimmunity.">Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 561-576 (2009).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Dynamics+of+Intratumoral+Immune+Cells+Reveal+the+Immune+Landscape+in+Human+Cancer.">Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer.</a> Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).</li><li>Gu-Trantien, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++follicular+helper+T+cell+infiltration+predicts+breast+cancer+survival.">CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 2873-2892 (2013).</li><li>Am&#233;-Thomas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intratumoral+follicular+helper+T+cells+in+follicular+lymphoma:+role+in+the+survival+of+malignant+B+cells.">Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells.</a> Leukemia. 26 (5), 1053-1063 (2012).</li><li>Bossaller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICOS+Deficiency+Is+Associated+with+a+Severe+Reduction+of+CXCR5+CD4+Germinal+Center+Th+Cells.">ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells.</a> The Journal of Immunology. 177 (7), 4927-4932 (2006).</li><li>Morita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Blood+CXCR5+CD4++T+Cells+Are+Counterparts+of+T+Follicular+Cells+and+Contain+Specific+Subsets+that+Differentially+Support+Antibody+Secretion.">Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion.</a> Immunity. 34 (1), 108-121 (2011).</li><li>Locci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+circulating+PD-1+CXCR3-CXCR5++memory+Tfh+cells+are+highly+functional+and+correlate+with+broadly+neutralizing+HIV+antibody+responses.">Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses.</a> Immunity. 39 (4), 758-769 (2013).</li><li>He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Precursor+CCR7loPD-1hi+CXCR5++CD4++T+Cells+Indicate+Tfh+Cell+Activity+and+Promote+Antibody+Responses+upon+Antigen+Reexposure.">Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure.</a> Immunity. 39 (4), 770-781 (2013).</li><li>Schmitt, N., Bentebibel, S. -. E., Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotype+and+functions+of+memory+Tfh+cells+in+human+blood.">Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood.</a> Trends in Immunology. 35 (9), 436-442 (2014).</li><li>Simpson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+circulating+T+cells+resembling+follicular+helper+T+cells+is+a+fixed+phenotype+that+identifies+a+subset+of+severe+systemic+lupus+erythematosus.">Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis and Rheumatism. 62 (1), 234-244 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequencies+of+activated+B+cells+and+T+follicular+helper+cells+are+correlated+with+disease+activity+in+patients+with+new-onset+rheumatoid+arthritis.">High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 174 (2), 212-220 (2013).</li><li>Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Circulating+T+Follicular+Helper+Cell+Subsets+in+Health+and+Disease.">Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease.</a> Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).</li><li>Maecker Holden, T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Function+of+CD4++T+Follicular+Helper+(Tfh)+Cells+Associated+with+Hepatocellular+Carcinoma+Progression.">Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression.</a> PLOS ONE. 10 (2), 0117458 (2015).</li><li>Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Tfh1+(cTfh1)+cell+numbers+and+PD1+expression+are+elevated+in+low-grade+B-cell+non-Hodgkin's+lymphoma+and+cTfh+gene+expression+is+perturbed+in+marginal+zone+lymphoma.">Circulating Tfh1 (cTfh1) cell numbers and PD1 expression are elevated in low-grade B-cell non-Hodgkin's lymphoma and cTfh gene expression is perturbed in marginal zone lymphoma.</a> PLOS ONE. 13 (1), 0190468 (2018).</li><li>Annunziato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+features+of+human+Th17+cells.">Phenotypic and functional features of human Th17 cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (8), 1849-1861 (2007).</li><li>Duan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotype+and+function+of+CXCR5+CD45RA-CD4++T+cells+were+altered+in+HBV-related+hepatocellular+carcinoma+and+elevated+serum+CXCL13+predicted+better+prognosis.">Phenotype and function of CXCR5+CD45RA-CD4+ T cells were altered in HBV-related hepatocellular carcinoma and elevated serum CXCL13 predicted better prognosis.</a> Oncotarget. 6 (42), 44239-44253 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+CXCR5+CD4+helper+T+cells+in+systemic+lupus+erythematosus+patients+share+phenotypic+properties+with+germinal+center+follicular+helper+T+cells+and+promote+antibody+production.">Circulating CXCR5+CD4+helper T cells in systemic lupus erythematosus patients share phenotypic properties with germinal center follicular helper T cells and promote antibody production.</a> Lupus. 24 (9), 909-917 (2015).</li><li>Sage, P. T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+PD-1+controls+follicular+regulatory+T+cells+in+the+lymph+nodes+and+blood.">The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood.</a> Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).</li><li>Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+T+follicular+regulatory+and+helper+cells+have+memory-like+properties.">Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).</li><li>Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+TFH+Cell+Function+and+Increased+TFR+Cells+Contribute+to+Defective+Antibody+Production+in+Aging.">Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging.</a> Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).</li><li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25+CD127low/-+T+Cells:+A+More+Specific+Treg+Population+in+Human+Peripheral+Blood.">CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood.</a> Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı periferik kan cTfh hücreleri, literatürde şimdiye kadar tanımlanan tüm ilgili alt kümeleri algılanmasını sağlayan analiz etmek için basit ve verimli bir şekilde temsil eder. Standart out-hasta klinikler ve seri örnekleri parçası klinik veri ile paralel olarak toplanabilir gibi kan örneklerini kolayca ve verimli bir şekilde elde edilebilir. Buna karşılık, bu prospektif çalışmalar hastalık ilerleme veya tedaviye yanıt için biyolojik olarak cTfh alt kümeleri değerlendirmek sa...

Foliküler T yardımcı hücreleri (Tfh) olan bir CD4+ başlangıçta lenfoid doku1' karakterize edildi T-hücre alt. Bu hücreler PD-1 ve CXCR5 yüzey reseptörlerinin ifade, IL-21 ve Il-4 salgılar ve transkripsiyon faktörü, BCL-62,3nükleer ifade gösterir. Onların adından da anlaşılacağı gibi germinal merkezleri bulunur ve yüksek afinite antikor üretim1için gereklidir.
Dysregulated Tfh yanıt-e doğru hastalık patogenezinde, burada autoreactive B hücreleri4genişlemesi teşvik en önemlisi otoimmün hastalık karıştığı olmuştur. Onlar da sağlam5,6 ve lenfoid kanserleri7tümör microenvironment bir rol oynamaktadır. Tersine, insan immün yetmezlik sendromları8indüklenebilir T-hücre costimulator (ICOS) sonucu gibi yüzey proteinleri Tfh için gerekli genetik kusurların işlev. CD4+ CXCR5+ insan periferik kan hücrelerinde foliküler T yardımcı hücreleri (cTfh) dolaşan denir ve bellek kartı yuvası Tfh hücre dokuları9olduğuna inanılmaktadır. Burada anlatılan yöntemin amacı CD4 takip cTfh alt kümeleri analizidir+ hücre izolasyon periferik kan örneklerinden.
Birkaç cTfh alt kümelerini tanımlanan ve B-hücre yardım hangi ile sağladıkları verimlilik bir alt başka bir9' a,10,11,12farklıdır. Şu alt kümeleri göreli oranlarını en belirgin otoimmün hastalık hangi orada olduğunu hemen hemen her zaman daha işlevsel PD-1 göreceli artış çeşitli hastalıklar, değiştirilmiş+/ Merhaba ve/veya cTfh2 veya cTfh17 alt kümeleri ile karşılaştırıldığında daha az fonksiyonel PD-1- ve/veya cTfh1 alt kümeleri12. Sık sık bu değişiklikleri kapsamını ilişkilendirmek bir potansiyel rolünü, cTfh alt dağıtım hastalığında Tfh içinde faaliyet yansıtabilir prognostik bir biyomarker olarak belirten hastalık aktivite ve antikor titreleri dahil olmak üzere klinik parametrelerle lenfoid doku9,12,13,14. Ayrıca, katılımcıların kan örnekleri alarak hızlı, güvenli ve kabul edilebilir ve çok hastalık ilerleme veya tedaviye yanıt analizi için izleme seri sağlar.
İzole CD4 kullanımı+ T-hücreleri üzerinde geleneksel periferik kan mononükleer hücre (PBMNC) süspansiyonlar cTfh hücre analizi için önemli bir sayı elde etmek için gereken süreyi azaltarak daha yüksek üretilen iş akış sitometresi deneyler sağlar. Nadir cTfh alt kümeleri akışı kullanarak hücrelerden sıralama (FACS) sıralama hücre aktif hale getirildiğinde bu özellikle yararlıdır. Verimliliği yardımcı olmak için bu süspansiyonlar "örnekleri akış sitometresi deneyde kullanılacak toplu iş oluşturma özelliğinin" etkinleştirmek için cryopreserved. Sınama, CD4+ saflık değil dondurma tarafından düşürüldü.
CTfh hücreleri kendi keşif yöntemi erken dönemlerinde kategorize etmek için kullanılan farklı laboratuvarlar farklı işaretleri burada sunulan iki grup olarak Schmidt vd.12, tarafından önerilen hücre yüzey işaretlerinin birleştirilmiş planı yapar kullanın eşzamanlı kimlik cTfh ve bir tek akış sitometresi içinde dokuz tanınan alt grupları etkinleştirmek için 15 deneme.
Tek hücre yüzey işaretleri kullanılan olarak hücreleri fiksasyon veya permeabilization gerekmez ve böylece aşağı akım fonksiyonel çalışmaları için hayatta kalabilir. Bu hücre FACS ile aynı antikor paneli kullanarak sıralama kolaylaştırılmış olacak. Bu panel için kullanılan akış sitometresi kısıtlamalar izin diğer işaretler, kapsayacak şekilde genişletildi.
Çok renkli akış sitometresi deneyler Analizi 2 boyutlu nokta araziler üzerinde özellikle ne zaman hücre popülasyonlarının net bı kalıcı dağıtım olarak işaret floresans içinde yok perdeleme doğal olarak öznel olması nedeniyle zor olabilir cTfh hücreleri ve alt grupları için durum. Bu nedenle, örneğin alınma olasılığını daha iyi çözünürlük etkinleştirmek için ve stratejileri güvenle geçişi ayarlamak için el eşyaları azaltmak için etkili denetimleri ayarlama zorunludur. Bu nedenle, antikor panel tasarım ve temel akış sitometresi denetimlerinde up, yani, değerinin kullanılması deneme ve FMO denetimleri özetlenen adım 3.4.2 ve 3.4.3,respectively.
Tüm cTfh hücreleri CD4 tanımlanan+ CXCR5+ CD45RA-. Alt kümelerine PD-1-, PD-1+ veya PD-1Merhaba cTfh hücreleri tanımlamak için ifade karakteristik Tfh harekete geçirmek işaretin PD-1 düzeyde sonra belirlenir. O zaman, kemokin reseptörleri CXCR3 ve CCR6 bir arada kullanarak, hangi differentially ifade tarafından geleneksel Th1, 2 ya da 17 hücreleri, cTfh cTfh1, 2-17 gibi CXCR3 bir profil tarafından olarak karakterize edilebilir+ CCR6-, CXCR3- CCR6- ve CXCR3- CCR6+, anılan sıraya göre.
Bizim laboratuvar tarafından kullanılan antikor paneli Tablo 1' de görüntülenir. Kullanıcı lazer ve ışık filtresi yapılandırması için kendi yerel akış sitometresi kullanılabilir hesap için kendi fluorophore seçimi adapte olabilir.
Aşağıdaki önemli noktalar fluorophores seçimi etkiler. Parlak fluorophores mümkün olduğunda kullanın. Özellikle, en parlak kullanılabilir fluorophores üzerinde dimmest (daha az yüksek ifade) işaretleri kullanın. PD-1, CXCR3 ve CCR6, dimmer işaretleri içerir ve daha az bir ölçüde, CXCR5. Özellikle yeni BB, BV ve BUV kullanmak yapılmış mükemmel parlaklık sağlamak ve böylece hücrelerin farklı nüfusun daha kolay çözünürlüğünü etkinleştirmek fluorophores.
Fluorophore seçim spektral örtüşme ve böylece gerekli tazminat düzeyini en aza indirmek mümkün olduğu kadar emisyon spectra arasında yayıldı. Akış Sitometresi Bölmesi tasarlamaya yardımcı olmak için kullanılan ücretsiz, online alet-ebilmek bulunmak burada: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Emisyon spektrumda yer kazanmak için bir "döküm kanal" ikisi de öldü algılama (ve dışlanma) etkinleştirmek için bu APC-H7 (CD45RA için Birleşik) ile örtüşen bir emisyon dalga boyu ile bir canlılık boya kullanarak çalıştırmaya başladık ve/veya CD45RA+ kullanarak bir tek dedektör.
Burada, bir protokol yalıtım+ T-hücrelerinin periferik kan CD4 ve onların daha sonraki analiz için farklı ve son zamanlarda açıklanan alt kümeleri dolaşan oranlarını belirlemek için akış sitometresi tarafından sunulur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1037px;" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail</td>
			<td style="width:179px;">STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td style="width:119px;">15062</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BUV395 Mouse Anti-Human CD183&#160;Clone 1C6/CXCR3</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>565223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6)&#160;Clone 11A9</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>563923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185)&#160;Clone&#160;RF8B2</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>562747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BB515 Mouse Anti-Human CD4&#160;Clone &#160;RPA-T4</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>564419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">PE Mouse Anti-Human CD279&#160;Clone MIH4</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen</td>
			<td>557946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone&#160; HI100</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen</td>
			<td>560674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L34973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Brilliant Stain Buffer</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td style="width:179px;">BD CompBead</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FACS Aria II Flow Cytometer</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FACSDiva 6.1.3</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td>643629</td>
			<td>Flow Cytometer Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FlowJo 10.2</td>
			<td style="width:179px;">Treestar Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flow Cytometry Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CXCR3 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">565223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CCR6 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">563923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CXCR5 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">562747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CD4 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">564419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-PD-1 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">557946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CD45RA antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">560674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Viability Marker</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L34973</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cd4+ t-cells and analysis of circulating t-follicular helper (ctfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry

Anormal T foliküler yardımcı (Tfh) hücre faaliyet otoimmün koşullarda tespit ve B hücreli non-Hodgkin Lenfoma lenf nodu microenvironment analiz zaman onların varlığı klinik sonuçlar ile ilişkilidir. Foliküler T yardımcı hücreleri (cTfh), dolaşımdaki bellek kartı yuvası Tfh hücrelerinin kan dolaşan alt kümeleri hastalığında da tedirgin ve bu nedenle potansiyel yeni akıllı biyolojik temsil eder. Çünkü nispeten non-invaziv ve basit seri izleme sağlar periferik kan tabanlı test avantajlıdır. CD4 izole bir yöntem bu makalede+ T-hücreleri insan kanı ve daha fazla analiz tarafından cTfh hücreleri ve çeşitli alt grupları oranlarını numaralandırmak için akış sitometresi (cTfhPD-1-/ + / Merhaba, cTfh1, 2, 17 ve cTfh1/17). Şu alt kümeleri düzeyini, normal konular ve hastalar arasında lenfoma ile karşılaştırıldı. Yöntem rutin olarak toplanan hasta malzemeden güvenilir sonuçlar elde etmek için sağlam olduğunu ortaya koymuştur. Biz analiz için tarif tekniği kolayca cep sıralama ve RT-PCR gibi aşağı akım uygulamaları için adapte edilebilir.

Yüksek CD4+ saflık elde CD4 kullanarak+ tüm kan örnekleri arasında güvenilir yalıtım Protokolü tarafımızca test (yani: %96.6, SD: 2.38, n = 31) (Şekil 3).
CTfh tanımlaması (CD4+ CXCR5+ hücreleri) konuda normal bir temsilcisi olan (Şekil 4A) sunulmaktadır. Toplam cTfh hücreleri CD4 içinde ora...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry at JoVE.com

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Burada, yalıtım ve CD4 karakterizasyonu için bir protokol+ T hücre alt kümeleri insan periferik kandan açıklanmıştır. Saf CD4+ T-hücreleri tarafından akış sitometresi T foliküler yardımcı hücresi alt kümeleri oranlarını belirlemek için analiz.

CD4 yalıtım+ T-hücreleri ve T foliküler Yardımcısı (cTfh) hücre alt kümeleri üzerinden periferik kan kullanarak 6-renk Akış Sitometresi Analizi, dolaşan

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Bu yöntem, sağlıklı ve hastalıklı durumlarda t-foliküler yardımcı hücre alt kümeleri dolaşan arasındaki farkları göstermek için yardımcı olabilir. Bu tekniğin en önemli avantajları hızlı olması, numunelerin toplu olarak işlenebileceği ve hücrelerin aşağı işlevsel analiz için hayatta kalmasıdır. Bu teknik, klinik önem belirteçleri ile ilişkili olarak hastalık ilerlemesi için biyobelirteçler olarak dolaşan T-foliküler yardımcı alt kümelerinin değerlendirilmesini kolaylaştırır. Bu prosedürün gösterilmesine yardımcı olan Dr. Lucia Pi.

isolation-cd4-t-cells-analysis-circulating-t-follicular-helper-ctfh

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

12.1K Görüntüleme.  University of Leicester. Bu yöntem, sağlıklı ve hastalıklı durumlarda t-foliküler yardımcı hücre alt kümeleri dolaşan arasındaki farkları göstermek için yardımcı olabilir. Bu tekniğin en önemli avantajları hızlı olması, numunelerin toplu olarak işlenebileceği ve hücrelerin aşağı işlevsel analiz için hayatta kalmasıdır. Bu teknik, klinik önem belirteçleri ile ilişkili olarak hastalık ilerlemesi için biyobelirteçler olarak dolaşan T-foliküler yardımcı alt kümelerinin değerl...

Video: Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

CD4 İzolasyon Miltenyi MACS Arıtma Fare lenf düğümleri + T hücreleri

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Biyoloji

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Akım Sitometri Kullanımı Ekstrasellüler Veziküller Analizi Teknikleri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Periferik kan Microvesicles izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and extremely large cell (40-60 &#181;m). As opposed to the fast-increasing knowledge in megakaryopoiesis at the cell biology and molecular level, the characterization of megakaryopoiesis by flow cytometry is limited to the identification of mature MKs using lineage-specific surface markers, while earlier MK differentiation stages remain unexplored. Here, we present an immunophenotyping strategy that allows the identification of successive MK differentiation stages, with increasing ploidy status, in human primary sources or in vitro cultures with a panel integrating MK specific and non-specific surface markers. Despite its size and fragility, MKs can be immunophenotyped using the above-mentioned panel and enriched by fluorescence-activated cell sorting under specific conditions of pressure and nozzle diameter. This approach facilitates multi-Omics studies, with the aim to better understand the complexity of megakaryopoiesis and platelet production in humans. A better characterization of megakaryopoiesis may pose fundamental in the diagnosis or prognosis of lineage-related pathologies and malignancy.

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Here, we present an immunophenotyping strategy for the characterization of megakaryocyte differentiation, and show how that strategy allows the sorting of megakaryocytes at different stages with a fluorescence-activated cell sorter. The methodology can be applied to human primary tissues, but also to megakaryocytes generated in culture in vitro.

İnsan Birincil Kaynaklarından veya Hematopoetik Progenitörlerden Farklılaştırılmış In Vitro'dan İnsan MK'larının İmmünofenoping ve Hücre Sıralama

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and ...

Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone regulation, barrier functions, and angiogenesis. Endothelial cell dysfunction is a hallmark predictor and major driver for the progression of severe cardiovascular diseases, yet the underlying mechanisms remain poorly understood. The ability to isolate and perform analyses on endothelial cells from various vascular beds in their native form will give insight into the processes of cardiovascular disease. This protocol presents the procedure for the dissection of mouse subcutaneous and mesenteric adipose tissues, followed by isolation of their respective arterial vasculature. The isolated arteries are then digested using a specific cocktail of digestive enzymes focused on liberating functionally viable endothelial cells. The digested tissue is assessed by flow cytometry analysis using CD31+/CD45&#8722; cells as markers for positive endothelial cell identification. Cells can be sorted for immediate downstream functional assays or used to generate primary cell lines. The technique of isolating and digesting arteries from different vascular beds will provide options for researchers to evaluate freshly isolated vascular cells&#160;from arteries of interest and allow them to perform a wide range of functional tests on specific cell types.

This protocol details a method for the dissection of mouse adipose depots and the isolation and digestion of respective arteries to liberate and then identify the endothelial cell population. Freshly isolated cells used in downstream applications will advance the understanding of vascular cell biology and the mechanisms of vascular dysfunction.

Vasküler Endotel Hücrelerinin Aşağı Akış Uygulamaları için Farklı Yağ Depolarından İzolasyonu ve Tanımlanması

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone ...

Murin Dermal Lenfatik Kılcal Damarlardan Endotel Hücrelerinin İzole Edilmesi

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

Yazar Spotlight: Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücrelerinin Manyetik Boncuk Tabanlı İzolasyonu

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücre İzolasyonu

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...