작업 전송 블록 끝을 MJA 백혈병 영국에서에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

혈액 샘플은 일반 과목 (NS)에서 가져온 (n = 12) 한계 영역 림프 종 (MZL) 환자 뿐만 아니라 (n = 7) B-세포 비-Hodgkin의 림프 종 (BNHL) (6 층 환자, 2 lymphoplasmacytic 림프 종 환자와 1 학년 B-세포의 비-Hodgkin의 림프 종 하지 않으면 지정 환자). 환자는 후 부여 하는 데, 장소에서 모든 연구에 대 한 윤리적인 승인을 서 면된 동의 레스터 로얄 실에서 혈액학 클리닉에서 채용 했다. 레스터, 노스 햄프셔와 러 틀 랜드 연구 윤리 위원회 1, 06/Q2501/122 환자 샘플 및 건강 연구 기관 (HRA) NRES 위원회 동부 미들 랜드 더비에 대 한 참조에 의해 윤리적인 승인을 얻은, 14/EM/1176에 대 한 참조 일반 과목입니다.
1. 절연 CD4의+ 전체 말 초 혈액에서 T-세포
<ol><li>K2EDTA 튜브 신선한 말 초 혈액 (2 ~ 15 mL) 표준 venipuncture 및 프로세스 최대 생존을 유지 하기 위해 가능한 한 빨리 가져가 라. 참고: 표준 실험실 개인 보호 장비 (코트, 장갑, 안경)을 사용 하 고 클래스 2 Biosafety 내각에서에서 업무를 수행.</li>
	<li>혈액 및 모든 필요한 시 약 (CD4+ 농축 칵테일, 식 염 2% 태아 둔감 한 혈 청/인산 버퍼 (FBS/PBS), 밀도 그라데이션 미디어, 그리고 동결 매체 경우 셀 cryopreserving) 실내 온도에.</li>
	<li>인간의 CD4의 농축에 대 한 항 체의 상용 칵테일 피 믹스+ T 세포. 시 약의 50 µ L를 사용 하 여 혈액의 각 1 ml. 혈액의 5 ~ 15 ml 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브를 사용 합니다. 참고: 2 ~ 4 mL의 혈액을 사용 하 여, 만약 14 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에이 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>20 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어.</li>
	<li>2%의 동등한 양으로 혼합 희석 FBS/PBS</li>
	<li>
이 희석된 혼합 밀도 그라데이션 미디어 인터페이스를 방해 하지 않도록 고 밀도 그라데이션 중간에 혈액의 확산 방지에 즉시 원심 분리를 천천히 위에 레이어.
	<ol>
<li>혈액의 2 ~ 3 mL, 14 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 혈액의 4 ml 3 mL 밀도 그라데이션 매체의 사용, 14 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 5 ~ 15 mL 혈액에 대 한 밀도 그라데이션 매체의 4 mL를 사용 밀도 그라데이션 매체의 15 mL 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 사용.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 ° c.에 떨어져 브레이크 1200 x g 20 분에 대 한 계층화 된 혼합물을 원심 참고: 아래 주위 온도 적혈구와 granulocytes 오염 될 수 있습니다. 낮은 속도 CD4 하면+ 실패 격리 프로세스. 종사 하는 휴식을 떠나 셀 생산량을 줄일 것 이다. 벤치 가기 원심 분리기를 사용 하 여에 어로 졸을 피하기 위해 폐쇄 될 수 있습니다로 터와.</li>
	<li>풍부한 CD4 제거+ 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 인터페이스에서 셀 레이어. 참고: 풍부한 셀 레이어 표준 "버 피 코트" 흰색 흐린 셀, 하지만 CD4만 닮은 것 이다+ 세포는 존재,이 자연스럽 게 작고 더 어려운 볼 수 있을 것입니다.</li>
	<li>추가 2 %FBS / PBS는 CD4에+ 10ml 2%로 두 번 다음 세척의 총 볼륨까지 셀 400 x g 에서 10 분 동안 각 세척 centrifuging 의해 FBS/PBS.</li>
	<li>펠 릿 2%에서 resuspend 셀 셀 번호 및 생존 능력을 결정 하는 중요 한 염료 (trypan blue)로 얼룩진 FBS/PBS 및 수.</li>
	<li>선택적 단계: 5 x 105 매체 (FBS에 10% 디 메 틸 sulfoxide) 1 mL aliquots에 1 x 106 셀에 resuspend. 참고: 일부 표면 마커 수준의 cryo 보전 및 해빙에 의해 변경할 수 있습니다. 그것은, 따라서, 매우 중요 한 모든 샘플 지속적으로 처리 됩니다. 분석 변수에서 차이 최소화 하기 위해 샘플 cryo 보존 하 고이 연구에서 분석에 대 한 일괄 처리 했다.</li>
</ol>2. Cytometry
<ol><li>해 동 cryopreserved CD4+ 37 ° C와 세척 한 번에 미리 따뜻하게 매체 (RPMI 1640 + L-글루타민 보충 10 %FBS 1 x 페니실린-스)에서 물 욕조에 신속 하 게 세포.</li>
	<li>매체, 400 x g 에 5 분 동안 원심 분리기의 9 mL에 셀을 추가 하 고 제거 하는 상쾌한.</li>
	<li>1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에 셀 resuspend (50 µ L) 5 x 105 와 1 x 106 세포 사이 사용 하는 각 상태를 테스트할 수 있도록.</li>
	<li>얼룩이 버퍼 셀 혼합 (50 µ L). 참고: 화려한 얼룩 버퍼 두 개 이상의 BV 또는 BUV 얼룩 이러한 염료의 고유한 화학적 특성 때문에 동시에 사용 하는 경우 데이터 분석을 방해할 수 있는 다양 한 얼룩 유물을 방지 합니다. 1%의 50 µ L 단일 또는 흠 없는 조건에서 빛나는 얼룩 버퍼의 50 µ L을 대체 하실 수 있습니다 BSA/PBS.</li>
	<li>(는 "볼륨 사용" 열 에서 표 1)에 의하여 세포에 항 체를 추가 하 고 30 분 동안 어둠 속에서 얼음에 품 어.</li>
	<li>1% 셀 두 번 씻어 600 x g 에서 3 분 동안 각 세척 centrifuging 여 BSA/PBS.</li>
	<li>1%에서 resuspend BSA/PBS (400 µ L) 및 교류 cytometry 수집 튜브를 전송.</li>
	<li>소용돌이 흐름 cytometer에서 데이터를 취득 하기 전에 부드럽게 셀:</li>
</ol>3. flow Cytometry 컨트롤 및 설정
<ol><li>흠 없는 샘플을 사용 하 여 설정 포토 다이오드 전압 세포는 명백한 파편과 죽은 세포 (높은 측면 살포 (SSC) 지역 및 낮은 앞으로 분산형 (FSC) 지역 이벤트)16에서 분리 될 수 있다. 단일 사용 하 여 샘플, 스테인드 설정 광 전 증폭 관 (PMT) 전압 긍정적인 형광 있는지 모든 이벤트 감지 규모에 속하는 하는 동안 배경 형광에서 분별 수 있습니다. 참고: 개선은 PMT 전압에 대 한 최적의 해상도 ("최고 2" 방법19)에 대 한 최소 전압을 찾을 어렴풋이 형광 비즈를 사용 하 여 각 PMT에 대 한 CV를 것입니다.</li>
	<li>단일 얼룩을 사용 하 여 캡처 구슬 보상 매트릭스를 생성 하 여 스펙트럼 중첩에 대 한 계정. 상업적으로 이용 가능한 보상 구슬 (60 µ L), 및 부정적인 제어 구슬 (60 µ L) 1%를 추가 BSA/PBS (100 µ L), 및 소용돌이. 참고: 사용 하는 캡처 구슬 호스트 종 및 사용 되는 항 체의 IgG isotype 일치 해야 합니다. 보상 매트릭스 해야 다시 계산 어떤 협동의 로트 번호 변경, 염색 하는 경우 그들은 그들의 방출 스펙트럼 제비 사이에서 상당한 가변성을 표시할 수 있습니다.</li>
	<li>단일 항 (20 µ L) 체와 소용돌이 추가 합니다.</li>
	<li>30 분 동안 어둠 속에서 실 온에서 품 어.</li>
	<li>10 분 동안 200 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>1%BSA/PBS에서 resuspend (500 µ L) 및 소용돌이.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 수집 소프트웨어에서 지정 된 보상 매트릭스 생성기를 사용 하 여 교류 cytometer와 샘플을 획득 합니다.</li>
	<li>사용 FMO 컨트롤 ≥4 색상16를 사용 하 여 실험에 배경 형광의 주요 원천입니다, 염료 유출에 대 한 계정에 긍정적인 마커 형광에 대 한 빌 게이츠의 위치를 안내 합니다. 따라 하지만 각 조건에 대해 3 단계에서에서 설명한 대로 프로토콜 일반 세포 표면 얼룩이 하나 얼룩 단계에서 fluorophores의 생략 (CD45RA 생략 하는 곳 또한 생략 라이브/죽은 얼룩). 각 조건에 대 한 100000 세포를 획득 합니다.</li>
	<li>셀의 ≤0.5 %에서 게이트 양성을 설정 합니다. FMO 컨트롤의 그림 예 그림 2 를 참조 하십시오.</li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>매우 작은 파편을 제외 하는 FSC 매개 변수에 5000 단위의 임계값을 설정할 흐름 cytometer 수집 소프트웨어를 사용 합니다.</li>
	<li>10000 cTfh 세포를 중지 게이트를 사용 (CD4+ CD45RA- CXCR5+). 참고: 개별 사용자는 10000 이상 세포를 수집할 수 있습니다. 이 숫자는 의미 있는 결과 컬렉션에 대 한 시간을 제공 하기 위해 충분 한 세포를 수집 사이 타협 이었다.</li>
	<li>FSC-영역을 사용 하 여 / SSC-지역 점 플롯, 파편을 제외 하는 동안 세포의 인구를 선택 하는 타원 또는 다각형 게이트 그리고 명백 하 게 죽은 세포 (높은 SSC-지역 및 낮은 FSC-지역 이벤트).</li>
	<li>FSC-영역을 사용 하 여 / FSC 폭 점 플롯, 다각형을 그리기 게이트 남자 (남자는 단일 셀에 비슷한 폭 하지만 증가 지역)을 제외 하는 동안 단일 셀을 선택.</li>
	<li>FSC-영역을 사용 하 여 / CD45RA 및 생존 표식 점 플롯, 라이브, CD45RA 선택 사각형 게이트 그릴- 셀 (이 표식에 대 한 낮은 형광으로).</li>
	<li>FSC-영역을 사용 하 여 / CD4 점 플롯, CD4 선택 사각형 게이트 그릴+ 세포 (이 표식에 대 한 높은 형광 세포).</li>
	<li>c d 4를 사용 하 여 CXCR5 점 플롯, / CXCR5 선택 사각형 게이트 그릴+ (즉, cTfh) 세포 (이 표식에 대 한 높은 형광 세포).</li>
	<li>CXCR3을 사용 하 여 / CCR6 점 줄거리, 장소 쿼드로 cTfh1, cTfh 세포를 세분 하 게이트 2와 17 셀 (셀 및 로우 각 표식에 대 한). 참고: 셀 형 CD4+ CXCR5+ CXCR3+ CCR6+ 는 가난 하 게 특징. 우리가 이러한 셀 참조 cTfh1/1718 로 때문에 기존의 헬퍼 T 세포 (CD4+ CXCR5-)는 Th1과 Th17 쇼 표현의 CXCR3와 CCR6 사이 전환 하 고 cTfh1/1719로 설명 되었습니다.</li>
	<li>범위 도구를 사용 하 여 cTfh 세포를 세분 하는 PD 1 히스토그램을 사용 하 여 (또는 경우, 개별 cTfh1 2, 17 또는 1/17 하위 선호) PD-1-/ + 또는 안녕 인구. 참고: PD-1+ 와 PD-1안녕하세요 의 차이 문학에서 잘 정의 되지 않습니다. 임계값은 선의의 Tfh 인간의 편도 선 림프 구 정지 같은 항 체 패널 cytometry 사용 하 여 검색 하는 데 필요한 같은 PD 1 강도로 설정 했다. 또는, PD1안녕하세요 셀만 ICOS+는 ICOS에 대 한 마커 항 체 패널에 추가할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

이 프로토콜 분석 주변 혈액 cTfh 셀, 지금까지 문학에서 확인 된 모든 관련 하위 집합의 검색을 활성화 하 간단 하 고 효율적인 방법을 나타냅니다. 혈액 샘플 얻어질 수 있다 쉽고 효율적으로 표준 외래 환자 진료소와 직렬 샘플의 일부 임상 데이터와 동시에 수집 될 수 있습니다. 차례 차례로, 질병의 진행 이나 치료에 대 한 생체로 cTfh 하위 집합을 평가 하는 예비 연구 수 있습니다. 이러한 연구?...

T-follicular 도우미 셀 (Tfh)는는 CD4+ 림프 조직1에서 처음 특징은 T 세포 부분 집합. 이러한 세포 PD-1, CXCR5 표면 수용 체를 표현 하 고 IL-21 및 IL-4 분 비 녹음 방송 요인, BCL-62,3의 핵 식 표시. 그들의 이름에서 알 수 있듯이, 그들은 어린 싹 센터에서 발견 되 고 높은 친 화력 항 체 생산1에 필수적인.
Dysregulated Tfh 응답 질병 병 인, 특히 자가 면역 질환, 그들은 autoreactive B 세포4의 확장을 추진 하는 어디에 연루 되었습니다. 그들은 또한 단단한5,6 의 림프 암7종양 microenvironment에서 역할을 재생할. 반대로, Tfh 필수적인 표면 단백질의 유전자 결함 인간 면역 결핍 증후군8T-셀 costimulator (ICOS) 결과 유도할 수 있는 등 기능. CD4+ CXCR5+ 인간의 말 초 혈액에서 순환 T-follicular 도우미 셀 (cTfh) 불린다 전지와 Tfh 세포 조직9에서 메모리 구획 될 것으로 추정 된다. 여기에 설명 된 방법의 목적은 CD4 다음 cTfh 하위 집합의 분석+ 세포 주변 혈액 샘플에서 격리.
여러 cTfh 하위 집합 정의 하는 그들은 B-세포 도움을 제공 하는 효율성 다른9,10,,1112하나의 하위 집합에서 다릅니다. 대부분 눈에 띄게 면역 질환 있는 거기는 거의 항상 더 기능 PD-1에서 상대 증가 질병의 숫자에서 변경 되는 이러한 하위 집합의 상대적 비율+ 안녕 또는 cTfh2 또는 cTfh17 하위 집합 덜에 비해 기능 PD-1- 또는 cTfh1 하위 집합12. 이러한 변경의 정도 자주 질병 활동과 autoantibody titers Tfh에서의 활동을 반영 될 수 있습니다 질병에서 예 후 바이오 마커로 cTfh 하위 집합 배포의 잠재적인 역할을 나타내는 등 임상 매개 변수 연관 림프 조직9,12,,1314. 또한, 참가자에 게 서 혈액 샘플을 채취는 빠르고, 안전 하 고, 허용 하며 그래서 직렬 질병의 진행 이나 치료에 응답의 분석에 대 한 모니터링
고립 된 c d 4 사용 하 여+ T-세포 전통적인 주변 혈액 단 셀 (PBMNC) 정지 이상 분석에 대 한 cTfh 셀의 상당한 수를 확보 하는 데 필요한 시간을 줄여 높은 처리량 흐름 cytometry 실험 수 있습니다. 이 흐름을 사용 하 여 희귀 cTfh 하위 집합에서 셀 정렬 셀 정렬 (FACS) 활성화 될 때 특히 도움이 됩니다. 효율성을 투입,이 정지 "일괄 처리" 교류 cytometry 실험에 사용 되는 샘플의 사용을 cryopreserved 수 있습니다. 테스트는 CD4+ 순도 cryopreservation 하지 감소 했다.
세포 표면 마커 슈미트 외.12, 에 의해 제안 된로 두 그룹의 통합된 체계의 사용 여기에 그들의 발견, 방법의 초기 단계에서 cTfh 셀 분류를 사용 하는 다른 실험실 다른 마커 제시 하는 동안 15 cTfh 및 단일 cytometry에 그들의 9 인식된 하위 집합의 동시 식별 수 있도록 실험.
유일한 세포 표면 마커를 사용 하는 셀 고정 또는 permeabilization, 필요 하지 않은 고 따라서 다운스트림 기능 연구에 대 한 살아으로 남아 있을 수 있습니다. 이 같은 항 체 패널 FACS를 사용 하 여 정렬 하는 세포에 의해 촉진 수 있습니다. 이 패널 교류 cytometer 사용의 제한에 대 한 허용 하는 다른 마커를 포함 하도록 확장 될 수 있습니다.
멀티 컬러 흐름 cytometry 실험의 분석 특히 때 세포 인구에에서 필요가 없습니다 분명 bi 모달 배포 마커 형광는 2 차원 점 작에 게이팅의 본질적으로 주관적인 성격 때문에 도전적 일 수 있다는 cTfh 세포와 그들의 하위 집합에 대 한 케이스입니다. 이러한 이유로, 그것은 인구의 더 나은 해상도 사용 하도록 설정 하 고 전략을 자신 있게 게이팅 설정 유물을 줄이기 위해 효과적인 컨트롤을 설정 하는 것이 필수적. 이와 같이 항 체 패널 디자인과 cytometry에 대 한 기본 컨트롤 설정 실험, 즉, 보상을 사용 하 여 및 FMO 컨트롤 단계 3.4.2와 3.4.3,respectively에 설명 되어 있습니다.
모든 cTfh 세포 CD4로 정의 된+ CXCR5+ CD45RA-. 표현의 특성 Tfh 활성화 마커 PD 1의 수준 하위 집합 PD-1-의 PD-1+ 또는 PD-1안녕하세요 cTfh 셀을 식별 하기 위해 다음 확인할 수 있습니다. 그런 다음, chemokine 수용 체 CXCR3 및 CCR6의 조합을 사용 하 여, 전통적인 Th1, 2 또는 17 셀, cTfh에 의해 표현 된 차동 나타낼 수 있다 cTfh1, 또는 CXCR3의 프로 파일에 의해 17-같은 2로+ CCR6-, CXCR3- CCR6- , 및 CXCR3- CCR6+, 각각.
우리의 실험실에서 사용 하는 항 체 패널은 표 1에 표시 됩니다. 사용자 자신의 로컬 교류 cytometer에서 사용할 수 있는 레이저와 빛 필터 구성에 대 한 계정에 그들의 fluorophore 선택 적응 해야 합니다.
다음 사항을 fluorophores의 영향. 가능한 경우 밝은 fluorophores를 사용 합니다. 특히, 흐릿한 (매우 보다 적게 표현된) 표식에 밝은 사용할 수 fluorophores를 사용 합니다. 주차 마커 포함 PD-1, CXCR3 및 CCR6, 그리고 조금 적게, CXCR5. 우리는 특히 BB, BV와 BUV의 최신 사용 하 여 만든 fluorophores 우수한 밝기를 제공 하 고 이렇게 세포의 고유한 인구의 쉽게 확인 가능.
Fluorophore 선택 방출 스펙트럼 스펙트럼 중복 및 따라서 요구 하는 보상의 수준을 최소화 하기 위해 가능한 한 많이 분산. 교류 cytometry 패널 설계를 지원 하기 위해 사용할 수 있는 무료 온라인 도구를 여기서 찾을 수 있습니다: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. 방출 스펙트럼에 공간을 절약 하기 위해 우리는 모두 죽은 감지 (및 제외) APC H7 (CD45RA 활용)와 겹치는 방출 파장을 가진 생존 염료를 사용 하 여 "덤프 채널"를 고용 또는 CD45RA+ 를 사용 하는 단일 탐지기입니다.
여기, 프로토콜 cytometry 다르고 최근 설명 순환 하위 집합의 비율을 결정 하 여 말 초 혈액 CD4의 절연은+ T-세포 및 그들의 연속적인 분석을 위해 제공 됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1037px;" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail</td>
			<td style="width:179px;">STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td style="width:119px;">15062</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BUV395 Mouse Anti-Human CD183&#160;Clone 1C6/CXCR3</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>565223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6)&#160;Clone 11A9</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>563923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185)&#160;Clone&#160;RF8B2</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>562747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BB515 Mouse Anti-Human CD4&#160;Clone &#160;RPA-T4</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>564419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">PE Mouse Anti-Human CD279&#160;Clone MIH4</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen</td>
			<td>557946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone&#160; HI100</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen</td>
			<td>560674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L34973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Brilliant Stain Buffer</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td style="width:179px;">BD CompBead</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FACS Aria II Flow Cytometer</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FACSDiva 6.1.3</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td>643629</td>
			<td>Flow Cytometer Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FlowJo 10.2</td>
			<td style="width:179px;">Treestar Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flow Cytometry Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CXCR3 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">565223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CCR6 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">563923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CXCR5 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">562747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CD4 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">564419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-PD-1 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">557946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CD45RA antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">560674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Viability Marker</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L34973</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cd4+ t-cells and analysis of circulating t-follicular helper (ctfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry

탈 T follicular 도우미 (Tfh) 셀 활동은 자기 면역 조건에서 감지 하 고 B-세포 비-Hodgkin의 림프 종에서 림프 노드 microenvironment 분석은 그들의 존재는 임상 결과와 관련. T follicular 도우미 셀 (cTfh), 혈액에 Tfh 셀의 순환 메모리 구획 순환의 하위 집합 또한 질병에서 불안정 하 고 따라서 잠재적인 새로운 예측 생체를 나타냅니다. 주변 혈액 기반 테스트 상대적으로 비 침략 적 이며 간단한 직렬 모니터링 수 있기 때문에 유리 하다. 이 문서는 CD4 격리 하기 위한 방법을 설명 합니다+ T-세포, 인간의 혈액과 cytometry cTfh 세포와 그들의 다양 한 하위 집합의 비율을 열거 하 여 추가 분석에서 (cTfhPD-1-/ + / 안녕, cTfh1, 2, 17, cTfh1/17). 이러한 하위 수준 다음 림프 종으로 일반 과목과 환자 사이 비교 되었다. 우리는 방법을 정기적으로 수집한 환자 자료에서 신뢰할 수 있는 결과 얻기 위해 충분히 강력한 발견. 기술 분석에 대 한 설명 셀 정렬 및 RT-PCR 같은 다운스트림 응용 프로그램에 쉽게 적응 될 수 있다.

높은 CD4+ 순도 c d 4를 사용 하 여 달성 되었다+ 회사에 의해 했다 모든 혈액 샘플에서 신뢰할 수 있는 격리 프로토콜 테스트 (의미: 96.6%, SD: 2.38, n = 31) (그림 3).
CTfh의 식별 (CD4+ CXCR5+ 세포) 대표 정상적인 주제에(그림 4)제공 됩니다. CD4 내?...

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Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

여기, 분리와 CD4의 특성에 대 한 프로토콜+ T-세포 인간 주변 혈액에서 하위 집합 설명. CD4 정화+ T-세포 cytometry T follicular 도우미 셀 하위 집합의 비율을 결정 하 여 분석 된다.

CD4의 격리+ T-세포 및 분석의 순환 T-follicular 도우미 (cTfh) 6 컬러 Flow Cytometry 주변 혈액을 사용 하 여에서 셀 하위 집합

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

이 방법은 건강하고 병들게 한 상태에서 순환 하는 T-여포 도우미 세포 하위 집합 사이의 차이점을 입증 하는 데 도움이 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 샘플이 일괄 처리 될 수 있으며 셀이 다운스트림 기능 분석을 위해 살아 있다는 것입니다. 이 기술은 임상 심각도의 마커와 상관 관계를 맺을 때 질병 진행을 위한 바이오마커로서 순환하는 T-여포 도우미 서브셋의 평가를 용이하게 합니다. 이 절차의 데모를 돕는 것은 박사 루시아 파이 될 것입니다

isolation-cd4-t-cells-analysis-circulating-t-follicular-helper-ctfh

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

12.0K 조회수.  University of Leicester. 이 방법은 건강하고 병들게 한 상태에서 순환 하는 T-여포 도우미 세포 하위 집합 사이의 차이점을 입증 하는 데 도움이 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 샘플이 일괄 처리 될 수 있으며 셀이 다운스트림 기능 분석을 위해 살아 있다는 것입니다. 이 기술은 임상 심각도의 마커와 상관 관계를 맺을 때 질병 진행을 위한 바이오마커로서 순환하는 T-여포 도우미 서브셋의 평가...

비디오: Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

연구

생물학

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

말초 혈액에서 마이크로 소포의 분리 및 특성

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

형광 기자 흐름 Cytometry 사용 pH-종속 mt-Keima에 의해 Mitophagy의 중요 한 측정

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

유세포측정에 의한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량 및 막 전위 측정

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and extremely large cell (40-60 &#181;m). As opposed to the fast-increasing knowledge in megakaryopoiesis at the cell biology and molecular level, the characterization of megakaryopoiesis by flow cytometry is limited to the identification of mature MKs using lineage-specific surface markers, while earlier MK differentiation stages remain unexplored. Here, we present an immunophenotyping strategy that allows the identification of successive MK differentiation stages, with increasing ploidy status, in human primary sources or in vitro cultures with a panel integrating MK specific and non-specific surface markers. Despite its size and fragility, MKs can be immunophenotyped using the above-mentioned panel and enriched by fluorescence-activated cell sorting under specific conditions of pressure and nozzle diameter. This approach facilitates multi-Omics studies, with the aim to better understand the complexity of megakaryopoiesis and platelet production in humans. A better characterization of megakaryopoiesis may pose fundamental in the diagnosis or prognosis of lineage-related pathologies and malignancy.

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Here, we present an immunophenotyping strategy for the characterization of megakaryocyte differentiation, and show how that strategy allows the sorting of megakaryocytes at different stages with a fluorescence-activated cell sorter. The methodology can be applied to human primary tissues, but also to megakaryocytes generated in culture in vitro.