Die Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss von Leukämie UK an ETB und MJA.

Blutproben wurden von gesunden Probanden (NS) erhalten (n = 12) sowie Patienten mit Lymphomen Randzone (MZL) (n = 7) und andere Arten von B-Zell non-Hodgkin Lymphom (BNHL) (6 FL Patienten, 2 Lymphoplasmacytic Lymphom-Patienten und 1 Low-Grade B-Zelle Non-Hodgkin Lymphom nicht anders angegeben Patienten). Patienten wurden aus der Hämatologie-Kliniken in Leicester Royal Infirmary rekrutiert, nachdem gegeben informiert, schriftliche Zustimmung mit ethischen Zulassung in Ort für alle Studien. Ethischen Genehmigung wurde von Northamptonshire und Leicestershire und Rutland Research Ethics Committee 1, Referenz 06/Q2501/122 für Patientenproben und Gesundheit Forschung Behörde (HFG) NRES Committee East Midlands-Derby, verweisen 14/EM/1176 für gesunden Probanden.
1. Isolation von CD4+ T-Zellen aus dem gesamten peripheren Blut
<ol><li>K2EDTA Röhrchen frische peripherem Blut (2 bis 15 mL) durch standard Venenpunktion und Prozess maximale Rentabilität so bald wie möglich zu berücksichtigen. Hinweis: Verwenden Sie Standardlabor persönliche Schutzausrüstung (Jacke, Handschuhe, Brille) und führen Sie die Arbeiten in einer Klasse II Biosafety Cabinet.</li>
	<li>Bringen Sie das Blut und alle notwendigen Reagenzien (CD4+ Bereicherung cocktail, 2 % fetalen bovine Serum/Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (FBS/PBS), Dichte-Gradienten-Medien und Einfrieren Medium wenn Zellen cryopreserving) auf Raumtemperatur.</li>
	<li>Mischen Sie das Blut mit einem handelsüblichen Cocktail von Antikörpern für die Bereicherung der menschlichen CD4+ T-Zellen. Verwenden Sie 50 µL des Reagenz für jeden 1 mL Blut. Verwenden Sie eine 50 mL konische Polypropylen-Rohr für 5 bis 15 mL Blut. Hinweis: Wenn Sie 2 bis 4 mL Blut verwenden, führen Sie diesen Schritt in einem 14 mL konische Polypropylen-Rohr.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 20 min.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Mischung mit einem gleichen Volumen von 2 % FBS/PBS</li>
	<li>
Diese verdünnte Mischung auf den Dichte-Gradienten-Medien langsam, um nicht zu stören das Interface und weiter zur Zentrifugation Diffusion des Blutes in das Dichte-Gradienten-Medium sofort zu überlagern.
	<ol>
<li>Verwenden Sie für 2 bis 3 mL Blut 3 mL Dichte Gradienten Medium in einem 14 mL konische Polypropylen-Rohr, aber für 4 mL Blut, 4 mL Dichte Gradienten Medium in einem 14 mL konische Polypropylen-Rohr und nach 5 bis 15 mL Blut , 15 mL Dichte Gradienten Medium in einem 50 mL konische Polypropylen Röhrchen verwenden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die vielschichtige Mischung für 20 min bei 1.200 X g mit der Bremse ab bei 20 ° C. Hinweis: Eine Temperatur unterhalb der Umgebungstemperatur kann die Verunreinigung mit Erythrozyten und Granulozyten führen. Eine niedrigere Geschwindigkeit bewirkt, dass die CD4+ Isolierung-Prozess fehlschlagen. Verlassen der Pause engagiert verringert Zellausbeute. Verwenden Sie eine Bank Top Zentrifuge mit Rotoren, die geschlossen werden können, zur Vermeidung von Aerosolen.</li>
	<li>Entfernen Sie die angereicherten CD4+ Zellschicht von der Schnittstelle mit einer Pasteurpipette. Hinweis: Der angereicherte Zellschicht wird einen Standard "buffy Coat" weiße bewölkt Zellen, sondern als nur CD4 ähneln+ Zellen vorhanden sind, wird dies natürlich kleiner und schwerer zu sehen.</li>
	<li>Fügen Sie 2 % FBS/PBS, die CD4 Zellen+ bis zu einem Gesamtvolumen von 10 mL und dann waschen zweimal mit 2 % FBS/PBS durch Zentrifugation für 10 min bei 400 X g bei jedem Waschgang.</li>
	<li>Das Pellet in 2 % Aufschwemmen FBS/PBS und Anzahl der Zellen gefärbt mit einem vital-Farbstoff (Trypan blau) zur Bestimmung der Zellzahlen und Lebensfähigkeit.</li>
	<li>Optionaler Schritt: 5 x 105 bis 1 x 106 Zellen im eiskalten Medium (10 % Dimethyl Sulfoxid in FBS) in 1 mL Aliquote aufzuwirbeln. Hinweis: Ebenen der einige Oberflächenmarker können durch Kryokonservierung und Auftauen verändert werden. Es ist daher sehr wichtig, dass alle Proben konsequent verarbeitet werden. Um die Unterschiede in der analytischen Variablen zu minimieren, wurden die Proben Cryo-bewahrt und für die Analyse in dieser Studie zusammengefasst.</li>
</ol>2. die Durchflusszytometrie
<ol><li>Tauen die kryokonservierten CD4-Zellen+ schnell in einem Wasserbad bei 37 ° C und Waschen einmal in vorgewärmten Medium (RPMI 1640 + L-Glutamin ergänzt mit 10 % FBS und 1 X Penicillin-Streptomycin).</li>
	<li>9 mL Medium, Zentrifuge für 5 min bei 400 X g die Zellen hinzufügen und Entfernen des Überstands.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zellen in 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS (50 µL) so, dass jede Bedingung getestet werden 5 x 105 bis 1 x 106 Zellen verwendet.</li>
	<li>Mischen Sie die Zellen mit Färbung Puffer (50 µL). Hinweis: Glänzende Flecken Puffer verhindert verschiedenen befleckenden Artefakte, die mit der Datenanalyse stören können, wenn zwei oder mehr BV oder BUV Flecken gleichzeitig aufgrund der inhärenten chemische Eigenschaften dieser Farbstoffe verwendet werden. In Einzel- oder ungefärbten Zustand 50 µL der brillante Fleck Puffer ersetzt werden kann, für 50 µL 1 % BSA/PBS.</li>
	<li>Zellen (gemäß der "Volume verwendet" Spalte in Tabelle 1) die Antikörper hinzu und auf Eis im Dunkeln für 30 min inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen zweimal in 1 % BSA/PBS durch Zentrifugieren für 3 min bei 600 X g bei jedem Waschgang.</li>
	<li>Aufschwemmen in 1 % BSA/PBS (400 µL) und Transfer zum Erwerb Strömungsrohr Zytometrie.</li>
	<li>Wirbel der Zellen sanft vor dem Importieren von Daten auf einem Durchflusszytometer:</li>
</ol>(3) flow Cytometry Kontrollen und Set-up
<ol><li>Mit einem ungefärbten Probe, Photodiode Spannungen so stellen Sie ein, dass Lymphozyten von offensichtlichen Schmutz und abgestorbenen Zellen (Ereignisse mit high-Side Scatter (SSC) und niedrigen forward Scatter (FSC) Bereich)16getrennt werden können. Mit gefärbten Einzelproben, Photomultiplier (PMT) Spannungen so stellen Sie ein, dass positive Fluoreszenz von Hintergrundfluoreszenz gleichzeitig sicherstellen, dass alle Ereignisse in der nachweisbaren Skala fallen auszumachen sind. Hinweis: Eine Verbesserung wäre, CV plot gegen PMT Spannung für jeden PMT mit schwach fluoreszierenden Perlen, um die minimale Spannung für optimale Auflösung ("Peak 2" Methode19) zu finden.</li>
	<li>Konto für spektrale Überlappung durch die Erzeugung einer Entschädigung-Matrix mit einzelnen Flecken mit Capture Perlen. Fügen Sie im Handel erhältlichen Entschädigung Perlen (60 µL) und Negativkontrolle Perlen (60 µL) auf 1 % BSA/PBS (100 µL) und Wirbel. Hinweis: Die Capture-Perlen verwendet, müssen der Wirtsarten und IgG Isotype des Antikörpers verwendet wird übereinstimmen. Die Vergütungsmatrix sollte neu berechnet, wenn die Lot-Nummer von jedem Tandem Änderungen, Farbstoffe, da erhebliche Variabilität in ihre Emissionsspektren zwischen vielen angezeigt werden kann.</li>
	<li>Fügen Sie eine einzelne Antikörper (20 µL) und Wirbel.</li>
	<li>Bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 min inkubieren.</li>
	<li>200 X g für 10 min Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.</li>
	<li>Aufschwemmen in 1%BSA/PBS (500 µL) und Wirbel.</li>
	<li>Erwerben Sie die Probe mit einem Durchflusszytometer mit dem dafür vorgesehenen Entschädigung-Matrix-Generator in der Datenerfassungs-Software gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>FMO Steuerelemente für die Platzierung der Tore für positive Marker Fluoreszenz für Farbstoff Spill over, Konto zu führen, welches die Hauptquelle der Hintergrundfluoreszenz in Experimenten mit ≥4 Farben16ist. Folgen der allgemeinen Zelloberfläche Färbung Protokoll wie in Schritt 3, jedoch für jede Bedingung weglassen einer des Fluorophore von der Färbung Schritt (wo CD45RA weggelassen wird, auch weglassen den lebenden/Toten Fleck). Erwerben Sie 100.000 Lymphozyten für jede Bedingung.</li>
	<li>≤0.5 % der Zellen die Tor-Positivität festgesetzt. Siehe Abbildung 2 illustriert beispielhaft FMO Kontrollen.</li>
</ol>(4) Datenanalyse
<ol><li>Setzen Sie das Durchflusszytometer Datenerfassungs-Software, eine Schwelle von 5.000 Einheiten auf der FSC-Parameter, sehr kleine Trümmer auszuschließen.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Tor stoppen, um 10.000 cTfh Zellen zu erwerben (CD4+ CD45RA– CXCR5+). Hinweis: Der einzelne Benutzer kann mehr als 10.000 Zellen zu sammeln. Diese Zahl war ein Kompromiss zwischen sammeln genug Zellen, um aussagekräftige Ergebnisse und der Zeitaufwand für die Sammlung zur Verfügung stellen.</li>
	<li>Mit einem FSC-Gebiet / SSC-Bereich-Dot-Plot, Zeichnen einer Ellipse oder ein Polygon Tor um die Bevölkerung von Lymphozyten zu wählen, während Trümmer ausgenommen und offenkundig toten Zellen (Veranstaltungen mit einem hohen SSC-Bereich und niedrige FSC-Bereich).</li>
	<li>Mit einem FSC-Gebiet / FSC-breite Dot Plot, zeichnen ein Polygon Gatter Einzelzellen jedoch ohne Dubletten (Doubletten müssen eine erhöhte Fläche aber ähnlichen breite Einzelzellen) auswählen.</li>
	<li>Mit einem FSC-Gebiet / CD45RA und Lebensfähigkeit Marker dot Plot, zeichnen Sie ein rechteckiges Tor um CD45RA Leben, wählen– Zellen (Zellen mit einem niedrigen Fluoreszenz für diese Markierung).</li>
	<li>Mit einem FSC-Gebiet / CD4 dot Plot, zeichnen Sie ein rechteckiges Tor markieren CD4+ Zellen (Zellen mit einer hohen Fluoreszenz für diese Markierung).</li>
	<li>Mit einem CD4 / CXCR5 dot Plot, zeichnen ein rechteckiges Tor markieren CXCR5+ (d.h. cTfh) Zellen (Zellen mit einer hohen Fluoreszenz für diese Markierung).</li>
	<li>Mit einem CXCR3 / CCR6 Dot-Plot, einen Quad Gatter, cTfh1, cTfh Zellen unterteilen 2 und 17 Zellen (Zellen, die für jede Markierung hoch und niedrig sind). Hinweis: Zellen mit dem Phänotyp CD4+ CXCR5+ CXCR3+ CCR6+ sind schlecht gekennzeichnet. Wir verweisen auf diese Zellen als cTfh1/17-18 , weil konventionelle Helfer T-Zellen (CD4+ CXCR5–), das sind Übergang zwischen Th17 und Th1 Show Ausdruck von CXCR3 und CCR6 und wurden als cTfh1/17-19beschrieben.</li>
	<li>Verwendung ein PD-1-Histogramm, das Auswahl-Werkzeug verwenden, um cTfh Zellen unterteilen (oder falls gewünscht, die einzelnen cTfh1 2, 17 oder 1/17 Teilmengen) in PD-1-/ + oder Hallo Populationen. Hinweis: Die Unterscheidung zwischen PD-1+ und PD-1Hallo ist nicht gut definiert, in der Literatur. Den Schwellenwert wurde als der gleichen PD-1 Intensität erforderlich, Bona-Fide Tfh in menschlichen Tonsillen Lymphozyten Suspensionen mit Durchflusszytometrie mit dem gleichen Antikörper-Panel zu erkennen. Alternativ kann ein Marker für die ICOS zum Fenster Antikörper hinzugefügt werden, da nur PD1Hallo Zellen ICOS+sind.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll stellt eine einfache und effiziente Möglichkeit, periphere cTfh Blutkörperchen, ermöglicht die Erkennung von allen relevanten Teilmengen identifiziert in der Literatur bisher zu analysieren. Blutproben können einfach und effizient erhalten werden, als Teil des standard ambulante Kliniken und serielle Proben parallel mit klinischen Daten gesammelt werden kann. Dies ermöglicht wiederum, prospektive Studien cTfh Teilmengen als Biomarker für die Progression der Erkrankung oder Reaktion auf die Behandlu...

T-Helfer Follikelzellen (Tfh) sind eine CD4+ T-Zell-Untergruppe, die zunächst im lymphatischen Gewebe1gekennzeichnet war. Diese Zellen express PD-1 und CXCR5 Oberfläche Rezeptoren, sezernieren IL-21 und IL-4 und zeigen nuklearen Expression des Transkriptionsfaktors, BCL-62,3. Wie ihr Name schon sagt, sie sind in germinal Center gefunden und sind unerlässlich für hohe Affinität Antikörper Produktion1.
Dysregulated Tfh Antworten waren in der Pathogenese der Krankheit, vor allem Autoimmun-Krankheit, verwickelt, wo sie den Ausbau der autoreaktiven B-Zellen-4zu fördern. Sie spielen auch eine Rolle in der Tumor-Mikroumgebung von solid5,6 und lymphatischen Krebserkrankungen7. Umgekehrt funktionieren Gendefekte Oberflächenproteine für Tfh z. B. induzierbaren T-Zelle Costimulator (ICOS) Ergebnis in menschlichen Immunodeficiency Syndrome8. CD4+ CXCR5+ Zellen im menschlichen peripheren Blut sind zirkulierende T-Helfer Follikelzellen (cTfh) bezeichnet und werden geglaubt, um das Speicherkartenfach der Tfh Zellen im Gewebe9sein. Die hier beschriebene Methode dient der Analyse der cTfh Teilmengen nach CD4+ Zell-Isolierung aus peripherem Blutproben.
Mehrere cTfh Teilmengen definiert wurden und die Effizienz, mit der sie B-Zell-Hilfe bieten, unterscheidet sich von einer Teilmenge um weitere9,10,11,12. Die relativen Anteile der diese Teilmengen werden in einer Reihe von Krankheiten, die meisten prominent Autoimmun-Krankheit, es fast immer eine relative Zunahme der funktioneller PD-1 ist verändert+ / Hallo /oder cTfh2 oder cTfh17 Teilmengen im Vergleich zu den weniger funktionale PD-1- und/oder cTfh1 Teilmengen12. Das Ausmaß dieser Veränderungen häufig assoziieren mit klinischen Parametern einschließlich Krankheit Aktivität und Autoantikörper-Titer, zeigt eine mögliche Rolle der cTfh Teilmenge Verteilung als prognostische Biomarker in Krankheit, die die Tätigkeit der Tfh in wiedergeben kann lymphatischen Gewebe9,12,13,14. Darüber hinaus Blutentnahme von Teilnehmern ist schnell, sicher und akzeptabel, und ermöglicht so serielle Überwachung für die Analyse der Krankheitsprogression oder Ansprechen auf die Therapie.
Die Verwendung von isolierten CD4+ T-Zellen über traditionelle peripherem Blut mononukleären Zellen (PBMNC) Suspensionen ermöglicht höhere Durchsatz Flow Cytometry Experimente reduziert den Zeitaufwand für eine beträchtliche Anzahl von cTfh Zellen für die Analyse zu erwerben. Dies ist besonders hilfreich, wenn Zellen aus seltenen cTfh Teilmengen mit Flow sortieren Zelle sortieren (FACS) aktiviert. Um die Effizienz zu unterstützen, können diese Suspensionen kryokonserviert werden damit "Dosierung" der Proben in den Flow Cytometry Experiment verwendet werden kann. Beim Testen der CD4+ Reinheit wurde nicht durch Kryokonservierung reduziert.
Während verschiedene Labors verwendet verschiedene Marker cTfh Zellen in den frühen Stadien ihrer Entdeckung, die Methode zu kategorisieren hier präsentiert nutzt eine einheitliche Regelung von zwei Gruppen der Zelloberfläche Marker wie vorgeschlagen von Schmidt Et Al.12, 15 ermöglichen die gleichzeitige Ermittlung der cTfh und ihre neun anerkannten Teilmengen in einer einzigen Durchflusszytometrie experimentieren.
Als einzige Zelle Oberflächenmarker verwendet werden, die Zellen benötigen keine Fixierung oder Permeabilisierung und können somit für nachgeschaltete funktionelle Studien lebendig bleiben. Dies könnte durch Zelle sortieren mit FACS mit dem gleichen Antikörper-Panel erleichtert werden. Dieses Panel könnte anderen Markern, zulassend die Einschränkungen der verwendeten Durchflusszytometer ausgeweitet werden.
Die Analyse der Multi-Color Flow Cytometry Experimente kann aufgrund der von Natur aus subjektiven Anspritzung auf 2-dimensionale Punkt plottet, vor allem als Zell-Populationen eine klare Bi-modale Verteilung Marker Fluoreszenz, da müssen nicht schwierig sein die bei cTfh Zellen und ihrer Untergruppen. Aus diesem Grund ist es zwingend notwendig, um wirksame Kontrollen einrichten, um die Artefakte ermöglichen besseren Auflösung von Populationen und gating Strategien selbstbewusst zu reduzieren. Als solche Antikörper-Panel-Design und den Aufbau der grundlegenden Steuerelemente für eine Durchflusszytometrie experimentieren, d. h. mit Entschädigung und FMO Kontrollen in Schritt 3.4.2 und 3.4.3,respectively beschrieben werden.
Alle cTfh Zellen sind definiert als CD4+ CXCR5+ CD45RA–. Das Niveau der Ausdruck des charakteristischen Tfh Aktivierung Markers PD-1 kann dann bestimmt werden, um die Teilmengen von PD-1-, PD-1+ oder PD-1Hallo cTfh Zellen zu identifizieren. Dann, mit einer Kombination von Chemokin-Rezeptoren CXCR3 und CCR6, die differenziell ausgedrückt werden durch traditionelle Th1, 2 bis 17 Zellen, cTfh kann charakterisiert werden als cTfh1, 2 bis 17-wie durch ein Profil von CXCR3+ CCR6-, CXCR3– CCR6- , und CXCR3– CCR6+, beziehungsweise.
Die Antikörper-Panel von unserem Labor verwendet wird in Tabelle 1angezeigt. Die Benutzer müssen ihre Fluorophor-Auswahl, um für die Laser und Lichtfilter Konfiguration auf ihre lokalen Durchflusszytometer Konto anzupassen.
Die folgenden Überlegungen beeinflussen die Wahl des Fluorophore. Verwenden Sie helle Fluorophore, soweit möglich. Insbesondere verwenden Sie die hellsten verfügbaren Fluorophore auf die dunkelsten (weniger hoch ausgedrückten) Markierungen. Dimmer Markierungen schließen ein PD-1, CXCR3 und CCR6, und in geringerem Maße, CXCR5. Wir speziell nutzte der neueren BB, BV und BUV Fluorophore, die ausgezeichnete Helligkeit und ermöglichen so einfacher Auflösung der unterschiedlichen Bevölkerungen der Zellen.
So weit wie möglich spektrale Überlappung und damit die Höhe der Entschädigung zu minimieren Emissionsspektren die Fluorophor Auswahl verteilt sind. Eine freie, Online-Tool, das verwendet werden kann, gerne entwerfen ein Flow-Zytometrie-Panel finden Sie hier: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Platzsparend auf das Emissionsspektrum beschäftigten wir einen "Dump-Kanal" mithilfe einer Lebensfähigkeit Färbung mit einer Emissionswellenlänge, die damit die Erkennung (und Ausgrenzung) der beiden Toten zu mit der APC-H7 Überschneidungen (konjugiert, CD45RA) und/oder CD45RA+ mit einem Detektor.
Hier ist ein Protokoll für die Isolierung des peripheren Blutes CD4+ T-Zellen und ihre anschließende Analyse von Durchflusszytometrie zu bestimmen, die Proportionen der verschiedenen und kürzlich beschriebenen zirkulierenden Teilmengen präsentiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1037px;" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail</td>
			<td style="width:179px;">STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td style="width:119px;">15062</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BUV395 Mouse Anti-Human CD183&#160;Clone 1C6/CXCR3</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>565223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6)&#160;Clone 11A9</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>563923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185)&#160;Clone&#160;RF8B2</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>562747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BB515 Mouse Anti-Human CD4&#160;Clone &#160;RPA-T4</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>564419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">PE Mouse Anti-Human CD279&#160;Clone MIH4</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen</td>
			<td>557946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone&#160; HI100</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen</td>
			<td>560674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L34973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Brilliant Stain Buffer</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td style="width:179px;">BD CompBead</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FACS Aria II Flow Cytometer</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FACSDiva 6.1.3</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td>643629</td>
			<td>Flow Cytometer Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FlowJo 10.2</td>
			<td style="width:179px;">Treestar Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flow Cytometry Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CXCR3 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">565223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CCR6 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">563923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CXCR5 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">562747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CD4 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">564419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-PD-1 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">557946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CD45RA antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">560674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Viability Marker</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L34973</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cd4+ t-cells and analysis of circulating t-follicular helper (ctfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry

Aberrante T follikulären Helfer (Tfh)-Zell-Aktivität ist im autoimmunen Bedingungen nachweisbar und ihre Anwesenheit ist mit klinischen Resultaten verbunden, wenn die Lymphknoten Mikroumgebung in B-Zell non-Hodgkin Lymphom analysiert wird. Teilmengen der zirkulierenden T-Helfer Follikelzellen (cTfh), die zirkulierenden Speicherkartenfach Tfh Zellen im Blut, sind auch bei Krankheit gestört und daher potenzielle neue Prädiktive Biomarker dar. Peripheren Blut-basiertes Testen ist vorteilhaft, weil es relativ nicht-invasiv und einfache Serienüberwachung ermöglicht. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Isolierung von CD4+ T-Zellen aus menschlichen Blut und weitere Analysen von Durchflusszytometrie, cTfh Zellen und die Proportionen von ihren verschiedenen Teilmengen auflisten (cTfhPD-1-/ + / Hallo, cTfh1, 2, 17 und cTfh1/17). Das Niveau dieser Untergruppen wurde dann zwischen gesunden Probanden und Patienten mit Lymphom verglichen. Wir fanden, dass die Methode robust genug, um routinemäßig erhobenen Patientenmaterial zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Die Technik, die wir für die Analyse beschreiben kann leicht Zellsortierung und downstream-Anwendungen wie RT-PCR angepasst werden.

Hohen CD4+ Reinheit wurde erreicht mit der CD4+ Isolierung-Protokoll, das über alle Blutproben zuverlässig wurde von uns getestet (bedeutet: 96,6 %, SD: 2,38, n = 31) (Abbildung 3).
Identifikation von cTfh (CD4+ CXCR5+ Zellen) in einem repräsentativen normalen Subjekt wird dargestellt (Abb. 4A). Der Anteil ...

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Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Hier, ein Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von CD4+ T-Zelle Teilmengen aus menschlichen peripheren Blut wird beschrieben. CD4 gereinigt+ T-Zellen werden analysiert, indem Durchflusszytometrie Proportionen des follikulären T Helfer-Zelle Teilmengen zu bestimmen.

Isolierung von CD4+ T-Zellen und Analyse von zirkulierenden T-follikulären Helfer (cTfh) Zelle Teilmengen von peripheren Blut mittels 6-Farb Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Diese Methode kann helfen, die Unterschiede zwischen zirkulierenden T-follikulären Helfer-Zell-Teilmengen in gesunden und kranken Zuständen zu demonstrieren. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie schnell ist, dass die Proben chargenverarbeitet werden können und dass die Zellen für die nachgelagerte funktionelle Analyse am Leben bleiben. Diese Technik erleichtert die Bewertung von zirkulierenden T-follikulären Hilfs-Subsets als Biomarker für das Fortschreiten der Krankheit, da sie mit Markern mit klinischer Schwere korrelieren. Mit helfen bei der Demonstration dieses Verfahrens wird Dr.Lucia Pi

isolation-cd4-t-cells-analysis-circulating-t-follicular-helper-ctfh

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

12.0K Aufrufe.  University of Leicester. Diese Methode kann helfen, die Unterschiede zwischen zirkulierenden T-follikulären Helfer-Zell-Teilmengen in gesunden und kranken Zuständen zu demonstrieren. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie schnell ist, dass die Proben chargenverarbeitet werden können und dass die Zellen für die nachgelagerte funktionelle Analyse am Leben bleiben. Diese Technik erleichtert die Bewertung von zirkulierenden T-follikulären Hilfs-Subsets als Biomarker für das Fortschreiten der Krankheit, da ...

Serie: Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolierung von CD4 + T-Zellen aus Maus-Lymphknoten mit Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Forschung

Biologie

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Techniken für die Analyse der extrazellulären Vesikeln mittels Durchflusszytometrie

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Isolierung und Charakterisierung von Mikrovesikeln aus peripherem Blut

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analyse von Zellsuspensionen isoliert von festen Geweben von Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

Empfindliche Messung des Mitophagy von Flow Cytometry Verwendung der pH-abhängigen fluoreszierende Reporter Mt-Otamegane

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotenzials in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen durch Durchflusszytometrie

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and extremely large cell (40-60 &#181;m). As opposed to the fast-increasing knowledge in megakaryopoiesis at the cell biology and molecular level, the characterization of megakaryopoiesis by flow cytometry is limited to the identification of mature MKs using lineage-specific surface markers, while earlier MK differentiation stages remain unexplored. Here, we present an immunophenotyping strategy that allows the identification of successive MK differentiation stages, with increasing ploidy status, in human primary sources or in vitro cultures with a panel integrating MK specific and non-specific surface markers. Despite its size and fragility, MKs can be immunophenotyped using the above-mentioned panel and enriched by fluorescence-activated cell sorting under specific conditions of pressure and nozzle diameter. This approach facilitates multi-Omics studies, with the aim to better understand the complexity of megakaryopoiesis and platelet production in humans. A better characterization of megakaryopoiesis may pose fundamental in the diagnosis or prognosis of lineage-related pathologies and malignancy.

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Here, we present an immunophenotyping strategy for the characterization of megakaryocyte differentiation, and show how that strategy allows the sorting of megakaryocytes at different stages with a fluorescence-activated cell sorter. The methodology can be applied to human primary tissues, but also to megakaryocytes generated in culture in vitro.

Immunphänotypisierung und Zellsortierung von humanen MKs aus menschlichen Primärquellen oder differenziert in vitro von hämatopoetischen Vorläufern