仕事は、ETB し会員数白血病英国からの助成金によって支えられました。

血液サンプルは健常者 (NS) から得られた (n = 12) 辺縁帯リンパ腫 (MZL) 患者だけでなく、(n = 7) および他の種類の B 細胞非ホジキン リンパ腫 (BNHL) (6 FL 患者、2, リンパ形質細胞性リンパ腫患者および 1 の低悪性度 B 細胞非ホジキン リンパ腫明記のない患者)。患者は情報を与えて、すべての研究のための場所で倫理的な承認を得て、書面による同意後レスターのロイヤル診療所で血液診療所から募集されました。倫理的な承認は、レスターシャー、ノーサンプトンシャー、ラトランド研究倫理委員会 1、患者のサンプルと健康研究機関 (HRA) システムオン委員会イースト ・ ミッドランズ-ダービーの 06/Q2501/122 参照によって得られた、14/EM/1176 を参照健常者。
1. CD4 の分離+全末梢血 T 細胞
<ol><li>K2EDTA 管に標準的な穿刺および最大実行可能性を維持するために、できるだけ早く処理による新鮮な末梢血 (2 に 15 mL) を取る。 注:規格研究所個人保護具 (コート、手袋、メガネ) を使用し、クラス II の安全キャビネットで仕事を遂行します。</li>
	<li>血とすべての必要な試薬をもたらす (CD4+トウキョウ セル場合凍結媒体密度勾配メディア、2% 胎仔ウシ血清/リン酸緩衝生理食塩水 (PBS/FBS) 濃縮カクテル) 室温に。</li>
	<li>血を混ぜて人間 CD4 の濃縮のための抗体の市販カクテル+ T 細胞。血のすべて 1 mL に試薬 50 μ L を使用します。血の 5 に 15 mL の 50 mL のコニカル ポリプロピレン チューブを使用します。 注:4 に 2 ミリリットルの血液を使用している場合は、この手順を実行 14 mL の円錐ポリプロピレン管で。</li>
	<li>20 分間室温で混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>2% の等量混合物を希釈 FBS/PBS</li>
	<li>
密度勾配メディア インターフェイスを妨害しないし、密度勾配媒体への血液の拡散を避けるためにすぐに遠心分離に進みますをゆっくりと上にこの希釈混合気を層します。
	<ol>
<li>2 に 3 ml の血、14 mL の円錐のポリプロピレン管ですが 4 mL の血液の密度勾配媒体 3 mL を使用してください、14 mL の円錐形ポリプロピレン管および 5 に 15 mL の血液の密度勾配媒体 4 mL を使用してください、50 mL コニカル ポリプロピレン チューブの密度勾配媒体 15 mL を使用しています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 ° C でブレーキをオフ 1,200 x gで 20 分間の層の混合物を遠心します。 注:以下周囲温度は赤血球および顆粒球による汚染にあります。低速は、CD4 を原因となります+分離プロセスが失敗します。従事して休憩を残して細胞収量が低下します。エアロゾルを防ぐために閉じることができるローターを備えたベンチ トップ遠心分離機を使用します。</li>
	<li>濃縮の CD4 を削除+パスツール ピペットを使用してインターフェイスから細胞層。 注:濃縮細胞層の標準「バフィー コート」cd4 陽性だけではなく白い曇りの細胞のようになります+細胞が存在、これは当然のことながら小さいと見づらい。</li>
	<li>追加 2 %fbs/PBS CD4 に+細胞量 10 mL、2% で 2 回洗いまで FBS/PBS 各洗浄中に 400 x gで 10 分間遠心分離。</li>
	<li>2% でペレットを再懸濁します細胞染色細胞数と生存率を決定する重要な染料 (トリパン ブルー) FBS/PBS とカウント。</li>
	<li>オプションのステップ: 5 x 105 1 ml 中 (FBS の 10% ジメチルスルホキシド) を凍結で 1 x 10 の6セルを再懸濁します。 注:低温保存と融解によっていくつかの表面のマーカーのレベルを改変すること。それは、したがって、非常に重要なすべてのサンプルが一貫して処理されます。分析変数の違いを最小限にするためサンプルは低温保存と本研究における解析のバッチだった。</li>
</ol>2. フローサイトメトリー
<ol><li>融解凍結 CD4+細胞 37 ° C、洗って一度に予め温めておいた媒体 (RPMI 1640 + L-グルタミン 10 %fbs と 1 x ペニシリン-ストレプトマイシン補完) で水バースの迅速に。</li>
	<li>9 mL 400 × gで 5 分間遠心分離媒体にセルを追加し、上清を除去します。</li>
	<li>PBS で 1% ウシ血清アルブミン (BSA) で細胞を再懸濁します (50 μ L) をそれぞれの条件をテストするのには、5 x 10 の5と 1 x 10 の6セルの使用します。</li>
	<li>セルを混ぜて染色バッファー (50 μ L)。 メモ: 華麗な染色バッファーは、これらの染料の固有の化学的性質により同時に使用する 2 つ以上の BV または BUV 汚れデータ分析を妨げる様々 な染色工芸品をできなくなります。鮮やかな染色バッファーの 50 μ L を 1% の 50 μ L に置き換えることが、単一または無染色条件で BSA/PBS。</li>
	<li>(あたりで表 1する「使用量」の列) のセルに抗体を追加し氷上で 30 分間暗闇の中で孵化させなさい。</li>
	<li>1% の 2 回セルを洗浄 BSA/PBS 各洗浄中に 600 x gで 3 分間遠心分離。</li>
	<li>1% で再懸濁します BSA/PBS (400 μ L) と流れ cytometry 取得管への転送。</li>
	<li>渦流れの cytometer でデータを取得する前に優しく細胞。</li>
</ol>3. 流れの Cytometry コントロールとセットアップ
<ol><li>明白な破片や死んだ細胞 (ハイサイド (SSC) の散布面積と低前方散乱 (FSC) エリア イベント)16からリンパ球を分離できるようにフォト ダイオード電圧を設定無染色のサンプルを使用します。単一のステンド グラス サンプルを使用すると、光電子増倍管 (PMT) 電圧ように設定すべてのイベントが検出可能な規模の内で落ちると確信して作っている間バック グラウンド蛍光から蛍光陽性が分かるでしょう。 注:改善すると、PMT 電圧に対して最適な解像度 (「ピーク 2」法19) の最低電圧を見つけるにぼんやりと蛍光ビーズを用いた各 PMT の CV をプロットします。</li>
	<li>キャプチャ ビーズと単一の汚れを使用して補償行列を生成することによりスペクトル重複アカウント。市販補償ビーズ (60 μ L) とネガティブ コントロール ビーズ (60 μ L) を 1% に追加 BSA/PBS (100 μ L) と渦。 注:使用するキャプチャ ビーズは、宿主および使用されている抗体の IgG アイソタイプを一致しなければなりません。補償行列必要があります再計算場合は、タンデムのロット番号染料変更、ロット間の発光スペクトルにおけるかなりの変動を表示できます。</li>
	<li>単一の抗体 (20 μ L) と渦を追加します。</li>
	<li>暗闇のなかで 30 分室温で孵化させなさい。</li>
	<li>200 x gで 10 分間遠心分離し、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>1%BSA/PBS で再懸濁します (500 μ L) と渦。</li>
	<li>製造元の指示に従って取得ソフトウェアで指定された補償行列ジェネレーターを使用して流れの cytometer でサンプルを取得します。</li>
	<li>FMO コントロールを使用して、≥4 色16の実験で背景の蛍光性の主要なソースである、染料の流出を考慮しての陽性マーカー蛍光のゲートの配置をご案内します。条件ごとに、ステップ 3 で説明一般的な細胞表面染色プロトコルに従って省略1 つの染色手順からフルオロ (CD45RA は省略すると、ただしライブ/死者の汚れは省略も)。条件ごとに 100,000 のリンパ球を取得します。</li>
	<li>セルの ≤0.5% でゲート陽性を設定します。FMO コントロールの図解例については図 2を参照してください。</li>
</ol>4. データ解析
<ol><li>非常に小さな破片を除外する FSC パラメーターに 5,000 台のしきい値を設定する流れの cytometer の集録ソフトウェアを採用してください。</li>
	<li>停止ゲートを使用して 10,000 の cTfh セルを取得 (CD4+ CD45RA- CXCR5+)。 注:個々 のユーザーは、以上 10,000 のセルを収集できます。この数は、意味のある結果と回収時間を提供するために十分なセルの収集間の妥協だった。</li>
	<li>FSC 領域を使用して/SSC 地域ドット プロット描画しながら破片を除くリンパ球の人口を選択する楕円や多角形ゲートとあからさま死んで細胞 (高い SSC 地域と低 FSC エリア イベント)。</li>
	<li>FSC 領域を使用して/FSC 幅ドット プロット、ポリゴンは描画ゲート (ダブレットがある単一のセルに同じような幅が拡大された領域) のダブレットを排除しながら単一のセルを選択します。</li>
	<li>FSC 領域を使用して CD45RA と生存率マーカー ドット プロット/ライブ、CD45RA を選択長方形のゲートを描く-細胞 (このマーカーの低蛍光細胞)。</li>
	<li>FSC 領域を使用して/CD4 ドット プロット、CD4 を選択長方形のゲートを描く+のセル (このマーカーの高い蛍光セル)。</li>
	<li>CD4 を使用して CXCR5 ドット プロット/CXCR5 を選択長方形のゲートを描く (このマーカーの高い蛍光細胞) 細胞の+ (すなわち、cTfh)。</li>
	<li>使用して、CXCR3/CCR6 ドット プロット、クワッドはゲートに cTfh1、cTfh セルを分割する 2 と 17 細胞 (高低各マーカーは、細胞)。 注:+ CXCR5 CD4 表現型と細胞+ CXCR3+ CCR6+は悪いが特徴します。我々 は cTfh1/1718としてこれらのセルを参照従来ヘルパー T 細胞 (CD4+ CXCR5-) CXCR3 の th17 細胞と th1 細胞の表示式と CCR6 の間の移行は、cTfh1/1719として記載されています。</li>
	<li>範囲ツールを使用して cTfh セルを分割 PD 1 ヒストグラムを使用して (または、個々 の cTfh1 2、17 または 1/17 のサブセットが好ましい場合) PD 1 に-/+またはこんにちは個体群。 注:PD 1+と PD 1こんにちは間の区別は文献で定義されています。しきい値は、同じ抗体パネルとフローサイトメトリーを用いたヒト扁桃リンパ球懸濁液の正真正銘の Tfh を検出するために必要な同じ PD 1 強度として設定されました。また、PD1こんにちはセルだけはアイコス+、ICOS のマーカーを抗体パネルに追加できます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+Helper+T+Cells.">Follicular Helper T Cells.</a> Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).</li><li>Nurieva, R. 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このプロトコルでは、これまで文献で識別されるすべての関連するサブセットの検出の有効化、末梢血 cTfh 細胞を分析するシンプルかつ効率的な方法を表します。標準的な外来患者診療所やシリアルのサンプルの一部は、臨床データと並行して集めることができるよう、血液サンプルを簡単に効率的に入手できます。ターンでは、これにより病気の進行や治療への反応のバイオ マーカーとし...

卵胞 T のヘルパー細胞 (Tfh) は、CD4+リンパ組織1で最初に特徴付けられた T 細胞サブセット。これらの細胞は、PD 1 と CXCR5 表面の受容器を表現、イリノイ 21 と IL-4 を分泌し、BCL 62,3転写因子の核の式を表示します。その名の通り、彼らは胚中心で発見され、1高親和性抗体の生産に欠かせない。
調節不全 Tfh の応答は、病気の発症、4自己反応性 B 細胞の拡大を促進する最も顕著な自己免疫疾患に関与しています。彼らはまた、固体5,6のリンパがん7腫瘍微小環境における役割を果たします。逆に、表面タンパク質 Tfh の必須の遺伝的欠陥は、ひと免疫不全症候群8誘導性 T 細胞 costimulator (アイコス) 結果など機能します。CD4+ CXCR5+ひと末梢血細胞濾胞 T のヘルパー細胞 (cTfh) と呼ばれている、Tfh 細胞組織9のメモリ実装部と考えられています。ここで説明したメソッドの目的は次の CD4 cTfh サブセットの解析+細胞の末梢血から分離。
いくつかの cTfh のサブセットが定義され、彼らが B 細胞の助けを提供効率は異なります 1 つのサブセット別9,10、11,12。これらのサブセットの相対的な割合は、そこでほとんどの目立つように自己免疫疾患がより機能的な PD 1 の相対的な増加ではほとんど常に、病気の数で変更されます+ こんにちは以下と比較して cTfh2 または cTfh17 のサブセットおよび/または機能的な PD-1-および cTfh1 サブセット12。これらの変更の程度は頻繁 cTfh サブセット分布の Tfh のアクティビティを反映可能性があります病気の予後バイオ マーカーとしての潜在的な役割を示す、疾患活動と自己抗体の抗体価を含む臨床パラメーターに関連付けるリンパ組織9,12,13,14。また、参加者からの血液採取は迅速、安全かつ許容できのでシリアル病気の進行や治療への反応の分析のための監視します。
孤立した CD4 の使用伝統的な末梢血単核細胞 (マーカー) 懸濁液上+ T 細胞 cTfh 細胞解析のための相当な数を取得する必要な時間を減らすことによってより高いスループット流れ cytometry 実験を有効にします。これは、セル (FACS) を並べ替え並べ替えの流れを使用して珍しい cTfh サブセットからセルをアクティブになったときに特に便利です。効率化を支援するために""流れの cytometry の実験で使用されるサンプルのバッチ処理を有効にするこれらの懸濁液を凍結保存することができます。テスト、CD4 の+純度は凍結によって減少されていません。
シュミットら12,によって提案されている細胞表面マーカーの 2 つのグループの統一された方式を使用して彼らの発見方法の初期の段階で cTfh 細胞を分類する使用される別の所の別のマーカーはここで紹介中15 cTfh と単一フローサイトメトリーでその 9 認識されたサブセットの同時識別を有効にするのに実験します。
唯一セル表面のマーカーを使用すると、セル固定や透過、不要、したがって下流の機能研究のため生きている残ることができます。FACS を用いた同じ抗体パネルを並べ替え] セルで、これを促進する可能性があります。このパネルは、使用されている流れの cytometer の制限を可能にする他のマーカーを含むように拡張可能性があります。
マルチカラー フロー フローサイトメトリー実験の分析は特に細胞集団が蛍光マーカーとしての明確なバイモーダル分布を持っていない場合, 2次元ドット プロットにゲーティングの本質的に主観的な性質のために挑戦することができます、cTfh 細胞およびそのサブセット用ケース。このため、人口のより良い解決を有効にして自信を持って戦略をゲートを設定する工芸品を減らすために効果的なコントロールを設定することが不可欠です。抗体パネル デザインとフローサイトメトリー用の基本的なコントロールのセットアップ実験、すなわち、補正し FMO コントロールのステップ 3.4.2 および 3.4.3,respectively のとおり。
CTfh のすべてのセルが CD4 として定義されている+ CXCR5+ CD45RA-。特性の Tfh 活性化マーカー PD 1 の表現のレベルは、PD 1-、PD 1+または PD 1こんにちはcTfh セルのサブセットを識別するために決定できます。その後、CCR6 と CXCR3 ケモカイン受容体の組み合わせを使用して、伝統的な Th1、2 または 17 細胞、cTfh によって発現するとして特徴付けられる cTfh1、2 または CXCR3 のプロフィールによって 17 のような+ CCR6-、CXCR3- CCR6-と CXCR3- CCR6+、それぞれ。
私たちの研究室で使用される抗体パネルは、表 1に表示されます。ユーザーは、彼らのローカル流れの cytometer 上使用可能なレーザーと光フィルター構成を考慮して、fluorophore 選択を適応させる必要があります。
次の考慮事項 fluorophores の選択に影響します。できるだけ明るい蛍光物質を使用します。特に、明度 (それほど高い表現) マーカーの最も明るい利用できる蛍光物質を使用します。PD 1、CXCR3 CCR6 などの調光器のマーカーとより少ない程度に、CXCR5。具体的には新しい BB、BV、BUV 使用してフルオロ優れた輝度を提供し、こうして細胞の異なる集団の簡単に解像度を有効にします。
発光スペクトルの重複そしてこうして必要な補償のレベルを最小限に抑えるため可能な限り分散 fluorophore 選択。流れ cytometry パネルの設計を支援するために使用することができます無料、フリー、オンライン ツールをここで見つけることができます: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer。発光スペクトルの領域を節約する両方の死者の検出 (および除外) 有効にする APC h7 (CD45RA に共役) と重なる部分発光波長性色素を用いた「ダンプ チャンネル」を採用または CD45RA+を使用して、単一の検出器。
ここでは、異なると最近記述されているサブセットを循環の割合を決定するためのフローサイトメトリーによる末梢血 CD4+ T 細胞の分離とその後の分析のためのプロトコルが表示されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1037px;" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail</td>
			<td style="width:179px;">STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td style="width:119px;">15062</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BUV395 Mouse Anti-Human CD183&#160;Clone 1C6/CXCR3</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>565223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6)&#160;Clone 11A9</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>563923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185)&#160;Clone&#160;RF8B2</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>562747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BB515 Mouse Anti-Human CD4&#160;Clone &#160;RPA-T4</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>564419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">PE Mouse Anti-Human CD279&#160;Clone MIH4</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen</td>
			<td>557946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone&#160; HI100</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen</td>
			<td>560674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L34973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Brilliant Stain Buffer</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td style="width:179px;">BD CompBead</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FACS Aria II Flow Cytometer</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FACSDiva 6.1.3</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td>643629</td>
			<td>Flow Cytometer Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FlowJo 10.2</td>
			<td style="width:179px;">Treestar Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flow Cytometry Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CXCR3 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">565223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CCR6 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">563923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CXCR5 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">562747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CD4 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">564419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-PD-1 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">557946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CD45RA antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">560674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Viability Marker</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L34973</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cd4+ t-cells and analysis of circulating t-follicular helper (ctfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry

異常 T 濾胞ヘルパー (Tfh) 細胞活性は自己免疫の条件の検出と B 細胞非ホジキン リンパ腫のリンパ節微小環境を分析するとき、彼らの存在は臨床結果と関連付けられました。循環 T 濾胞ヘルパー細胞 (cTfh)、Tfh 細胞、血液中の循環メモリ コンパートメントのサブセットが病気で混乱も、したがって、潜在的な新規予測バイオ マーカーを表します。末梢血でのテストは、比較的非侵襲的な単純なシリアルを監視できますので便利です。CD4 を分離する方法について説明します+ T 細胞人間の血液さらに cTfh 細胞としてのさまざまなサブセットの割合を列挙するフローサイトメトリーによる解析から (cTfhPD 1-/+ こんにちは、cTfh1、2、17、cTfh1/17)。これらのサブセットのレベルは、リンパ腫と健常者と患者間比較しました。メソッドが定期的に集められた患者材料から信頼性の高い結果を得るに十分な堅牢なことがわかった。分析について述べる技術は、細胞選別と RT-PCR などダウン ストリーム アプリケーションを簡単に適合できます。

高い CD4+純度は、CD4 を使用して達成された+隔離のプロトコルは、すべての血液サンプルの間で信頼性があったが私たちによってテスト (意味: 96.6%、SD: 2.38、n = 31) (図 3)。
CTfh の同定 (CD4+ CXCR5+細胞) 代表的な健常者では提案する (図 4A...

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Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

ここでは、分離と CD4 のキャラクタリゼーションのためのプロトコル+ T 細胞サブセットひと末梢血からの説明。CD4 精製+ T 細胞は濾胞 T のヘルパー細胞のサブセットの割合を決定するためのフローサイトメトリーで分析しました。

CD4 の分離+ T 細胞および循環の解析 T 濾胞ヘルパー (cTfh) 末梢血を使用して 6 色フローサイトメトリーから細胞のサブセット

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

この方法は、健康な状態と病気の状態で循環T濾胞ヘルパー細胞サブセットの違いを実証するのに役立ちます。この手法の主な利点は、高速でサンプルをバッチ処理できること、および下流の機能分析のためにセルが生き続ける点です。この技術は、疾患進行のバイオマーカーとして循環T-濾胞ヘルパーサブセットの評価を促進し、臨床的重症度のマーカーと相関する。この手順のデモンストレーションを手伝うのが博士ルチア・パイです

isolation-cd4-t-cells-analysis-circulating-t-follicular-helper-ctfh

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

12.0K ビュー.  University of Leicester. この方法は、健康な状態と病気の状態で循環T濾胞ヘルパー細胞サブセットの違いを実証するのに役立ちます。この手法の主な利点は、高速でサンプルをバッチ処理できること、および下流の機能分析のためにセルが生き続ける点です。この技術は、疾患進行のバイオマーカーとして循環T-濾胞ヘルパーサブセットの評価を促進し、臨床的重症度のマーカーと相関する。?...

ビデオ: Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

CD4 +ミルテニーMACS精製を使用してマウスのリンパ節からT細胞の分離

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

生物学

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

新生児マウスからの肺血管内皮細胞の単離と培養

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

フローサイトメトリーを用いて細胞外小胞の分析のための技術

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

末梢血からの微小胞の単離とキャラクタリゼーション

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

スペクトラルフローサイトメトリーにより固形組織から単離された細胞懸濁液の分析

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

蛍光レポーターの pH 依存性を用いたフローサイトメトリー流 mt 桂馬によって Mitophagy の高感度測定

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

造血幹細胞とT細胞におけるミトコンドリア質量と膜電位の測定

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and extremely large cell (40-60 &#181;m). As opposed to the fast-increasing knowledge in megakaryopoiesis at the cell biology and molecular level, the characterization of megakaryopoiesis by flow cytometry is limited to the identification of mature MKs using lineage-specific surface markers, while earlier MK differentiation stages remain unexplored. Here, we present an immunophenotyping strategy that allows the identification of successive MK differentiation stages, with increasing ploidy status, in human primary sources or in vitro cultures with a panel integrating MK specific and non-specific surface markers. Despite its size and fragility, MKs can be immunophenotyped using the above-mentioned panel and enriched by fluorescence-activated cell sorting under specific conditions of pressure and nozzle diameter. This approach facilitates multi-Omics studies, with the aim to better understand the complexity of megakaryopoiesis and platelet production in humans. A better characterization of megakaryopoiesis may pose fundamental in the diagnosis or prognosis of lineage-related pathologies and malignancy.

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Here, we present an immunophenotyping strategy for the characterization of megakaryocyte differentiation, and show how that strategy allows the sorting of megakaryocytes at different stages with a fluorescence-activated cell sorter. The methodology can be applied to human primary tissues, but also to megakaryocytes generated in culture in vitro.