שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך את ההשפעות של חסינות קיימת מראש נגד וירוס דנגי על זיהום וירוס זיקה, באמצעות סרום החולה האנושי בפועל ותאי החיסון האנושיים העיקריים. השימוש בדגימות סרום אנושיות בפועל ותאים ראשוניים אנושיים מספק תובנה עמוקה יותר לגבי השיפור תלוי הנוגדנים של נגיף זיקה על ידי סרה טרום חיסונית ונוגדנים. שיטה זו מספקת תובנה על היכולת של נוגדנים בתוך הדם של המטופל כדי לשפר את זיהום וירוס בתאים אנושיים אחרים.
חשוב להבטיח כי רמות הזיהום הנגיפי גבוהות מספיק לגילוי אך נמוכות מספיק כדי לא להציף את התאים או להפריע לפרשנות הנתונים. התחל על ידי זריעת שלוש פעמים עשר לתאים הרביעיים ב 100 microliters של מדיום תאים ל הבאר בסטרילי, שטוח התחתון 96-well צלחת. כאשר כל התאים כבר מצופים, מניחים את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני אינקובטור ולעשות 10 דילול סדרתי פי 10 של דגימות סרום אנושי מופשר במדיום ללא סרום.
הקפד לשמור על דילול הסרום וגורם הדילול קבוע עבור כל הסרומים הטרום חיסוניים לפני הוספת הדילול לפתרונות הנגיף ולתאים. לאחר מכן, להפשיר זיקה וירוס זני פתרון מלאי באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 דקות לפני במהירות להעביר את המניה לקרח. הוסף 0.1 ריבוי של נפח זיהום שווה ערך של וירוס זיקה אל aliquots סרום ולמקם את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך שעה אחת כדי לאפשר נוגדנים וירוס דנגי ליצור קומפלקסים עם נגיף זיקה.
בסוף הדגירה, לשטוף את התאים עם 100 microliters של PBS לגם ולהוסיף 50 microliters של קומפלקס המערכת החיסונית לכל באר. לאחר הדגירה של שעתיים, להסיר את המדיום ולשטוף את בארות פעמיים עם 100 microliters של PBS לגם כדי להסיר לחלוטין את העורקים החיסונית ואת כל virions מחובר. לאחר מכן להאכיל את התאים עם 100 microliters ל הבאר של תא תרבות בינוני בתוספת 10% נסיוב חזיר עוברי.
ואז להחזיר את התאים לאנקובטור תרבות התא במשך 48 שעות. יומיים לאחר הזיהום, לשטוף את התאים פעמיים עם 100 microliters של PBS סטרילי ל הבאר לפני הוספת 250 microliters של מאגר תות תא עם 10%beta mercaptoethanol לכל באר. פיפטה למעלה ולמטה לפחות חמש פעמים עם גירוד כדי להאיץ את תהליך תיזה ולהעביר את lysates התא סטרילי שכותרתו 1.5 צינורות מיליליטר.
הוסף נפח שווה של 70%אתנול לכל צינור ו pipette פתרון lysate למעלה ולמטה ארבע עד חמש פעמים. כאשר המתלים lysate ברורים, להעביר כל פתרון לטורים מבוססי סיליקה שכותרתו בשני צינורות איסוף מיליליטר עבור צנטריפוגה. השלך את הזרימה דרך שמירה על העמודים באותם צינורות איסוף ולהוסיף 700 microliters של שטיפת Buffer 1 לכל עמודה עבור צנטריפוגה שנייה.
לאחר השלכת הזרימה דרך, לשטוף את העמודים פעמיים נוספות עם 500 microliters של שטיפת Buffer שתיים לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, מעבירים את העמודים לצינורות איסוף חדשים של שני מיליליטר לצנטריפוגה נוספת. הוסף 30 microliters של 42 מעלות צלזיוס RNase ללא מים למרכז של כל עמודה עבור צנטריפוגה לשחזר את RNA אלוט.
לתגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת או ניתוח QRTPCR להוסיף מיקרוליטר אחד של פריימרים גנים ספציפיים קדימה ואחורי מ 10 מניות micromolar יחד עם 0.25 microliters של תערובת תעתיק הפוך לכל תגובה. שים לב כי פריימרים המזהים חומר גנטי וירוס זיקה יזהו גנים ויראליים ולאפשר כימות זיהום. לאחר מכן, להוסיף 12.5 microliters של תערובת ירוקה SYBR ואחריו 25 microliters של מים לכל תגובה הוספת 15 microliters של מאסטר לערבב בכל באר של צלחת QPCR 96-well.
בעת שימוש בתערובת מאסטר, להוסיף 100 ננוגרם של מדגם RNA לתערובת פיפטה לערבב מאסטר לתוך בארות בודדות של צלחת QRTPCR. שים לב שיש להפעיל דגימות ב- triplicate על אותו לוח QRTPCR. לאחר מכן הפעל את הדגימות במחשב PCR כמותי בהתאם לפרמטרים המתוארים בטבלה.
לחיצה על לשונית עקומת ההמסה בתוכנת המערכת כדי לפקח על עקומת ההמסה. עקומת ההמסה תראה שיא אחד בכל הדגימות לגן מסוים כדי לאשר את נוכחותו של אמפיקון אחד בלבד. לקבלת תוצאות מיטביות, השתמש במרווחי טמפרטורה של 0.5 מעלות צלזיוס בין השלבים ותזמן החזקה מינימלי של 10 שניות בפרוטוקול עקומת ההמסה.
לאחר מכן לחץ על הכרטיסיה נתוני כימות כדי לקבל מחזור כמותי עבור כל דוגמה ולייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני לניתוח כימות נוסף. ניתן לסווג את דגימות הסרום האנושי לשלוש קבוצות שונות: דגימות מאושרות של זיהום נגיף דנגי, דגימות מאושרות של נוגדנים לנגיף דנגי, וסרה בריאה ללא וירוס דנגי המנטרל נוגדנים או רנ"א. לאחר 48 שעות של זיהום, ניתוח QRTPCR מדגים כי רוב sera המכיל סרוטיפ וירוס דנגי אחד עד ארבעה נוגדנים מסוגלים לשפר את שכפול וירוס זיקה ברמות שונות.
העלייה הגבוהה ביותר של ציטרים וירוס זיקה נמצא מקרופאגים שטופלו סרוטיפ וירוס דנגי המכיל סרה שניים וארבעה נוגדנים לעומת סרוטיפ אחד ושלוש אשר מראים אינדוקציה נמוכה יחסית של וירוס זיקה. חשוב לשמור על סביבה סטרילית, ללבוש את ציוד ההגנה האישי הנכון, ותמיד לשמור את דגימות סרום הנגיף המופשרות ואת רייגנטים QPCR על קרח. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות שונה כדי לחקור שיפור תלוי נוגדנים של flavivirus אחרים כגון וירוס קדחת צהובה, וירוס דנגי, או וירוס הנילוס המערבי באמצעות פאנל של סרום החולה.
טכניקה זו תהיה שימושית מאוד לביצוע מחקרי שיפור תלויי נוגדנים עתידיים בתחומי ארבווירוס או וירולוגיה. יש להשתמש בכל עת בציוד הגנה אישי ברמה ביו-בטיחותית נכונה, ויש לפענח את כל הפסולת הנגיפית ב-10% אקונומיקה למשך 30 דקות לפני ההשלכה.
