이 방법은 실제 인간 환자 혈청 및 1 차적인 인간 면역 세포를 사용하여 Zika 바이러스 감염에 뎅기열 바이러스에 대하여 기존 면제의 효력을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. 실제 인간 환자 혈청 샘플과 인간 1 차 세포의 사용은 사전 면역 세라 및 항체에 의한 Zika 바이러스의 항체 의존성 향상에 대한 심층적인 통찰력을 제공합니다. 이 방법은 다른 인간 세포에 있는 바이러스 감염을 강화하기 위하여 환자의 혈액 내의 항체의 기능에 통찰력을 제공합니다.
바이러스 감염 수준이 검출을 위해 충분히 높지 만 세포를 압도하거나 데이터 해석을 방해하지 않을 만큼 충분히 낮다는 것을 확인하는 것이 중요합니다. 멸균, 평평한 바닥 96-웰 플레이트에서 잘 세포 배양 배지의 100 마이크로리터에서 제4 세포에 세 번 10번 을 파종하여 시작한다. 모든 세포가 도금되었을 때, 플레이트를 섭씨 37도 및 이산화탄소 인큐베이터 5%에 놓고 해동된 인간 혈청 시료를 혈청 프리 배지에 10배 연속 희석합니다.
바이러스 솔루션 및 세포에 희석제를 추가하기 전에 모든 면역 세럼에 대한 혈청 희석 및 희석 계수를 일정하게 유지해야 합니다. 다음으로, Zika 바이러스는 신속하게 얼음에 주식을 전송하기 전에 1 ~ 2 분 동안 섭씨 37도 수조에 재고 솔루션을 균주. 혈청 알리쿼트에 Zika 바이러스의 감염 동등한 부피의 0.1 복합성을 추가하고 뎅기열 바이러스 항체가 Zika virions와 복합체를 형성할 수 있도록 1 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 배치합니다.
인큐베이션이 끝나면 우물당 100마이크로리터의 PBS로 세포를 세척하고 각 웰에 50마이크로리터의 면역 복합체를 추가합니다. 2 시간 인큐베이션 후, 배지를 제거하고 우물당 100 마이크로리터의 PBS로 우물을 두 번 씻아 면역 복합체및 부착되지 않은 비리온을 완전히 제거합니다. 그런 다음 10%의 태아 소 혈청으로 보충된 세포 배양 배지의 웰당 100 마이크로리터로 세포를 공급한다.
그런 다음 세포를 세포 배양 인큐베이터로 48시간 동안 되돌려 보입니다. 감염 이틀 후, 각 웰에 10%의 베타 머카토에탄올이 있는 세포 리시스 버퍼 250 마이크로리터를 첨가하기 전에 잘 100마이크로리터의 멸균 PBS로 세포를 두 번 세척한다. 파이펫은 리스시 공정속도를 높이고 세포 리스를 1.5 밀리리터 튜브로 살균하기 위해 긁힘으로 적어도 5번 위아래로 감았다.
각 튜브에 70%에탄올의 동일한 볼륨을 추가하고 용액을 4~5회 위아래로 피펫합니다. lysate 서스펜션이 명확하면 각 솔루션을 원심 분리를 위해 2밀리리터 수집 튜브에 레이블이 부착된 실리카 기반 컬럼으로 전송합니다. 동일한 수집 튜브에 컬럼을 유지하는 흐름을 버리고 두 번째 원심 분리를 위해 각 열에 700 마이크로리터의 Wash 버퍼 1을 추가합니다.
흐름을 폐기한 후, 세척당 500 마이크로리터의 세차 버퍼 2개로 컬럼을 두 번 더 헹구십시오. 두 번째 세척 후 컬럼을 새로운 2밀리리터 수집 튜브로 옮겨 다른 원심분리를 합니다. 원심분리를 위해 각 컬럼의 중앙에 42도 의 30 마이크로리터를 추가하고 용출된 RNA를 복구합니다.
정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 또는 QRTPCR 분석을 위해 반응당 역전사 믹스의 0.25 마이크로리터와 함께 10개의 마이크로몰라 주식으로부터 유전자 특이적 전방 및 역프라이머1개의 마이크로리터를 첨가한다. Zika 바이러스 유전 물질을 인식하는 프라이머는 바이러스 유전자를 검출하고 감염 정량화를 허용할 것입니다. 다음으로, SYBR 그린 믹스의 12.5 마이크로리터를 추가하고 각 반응에 25 마이크로리터의 물을 추가하여 96웰 QPCR 플레이트의 각 웰에 마스터 믹스 15 마이크로리터를 추가합니다.
마스터 믹스를 사용하는 경우, 혼합에 RNA 샘플의 100 나노그램을 추가하고 마스터 믹스를 QRTPCR 플레이트의 개별 우물에 파이펫한다. 샘플은 동일한 QRTPCR 플레이트에서 트리플리케이트로 실행되어야 합니다. 그런 다음 테이블에 설명된 매개 변수에 따라 정량적 PCR 컴퓨터에서 샘플을 실행합니다.
시스템 소프트웨어의 용융 곡선 탭을 클릭하여 용융 곡선을 모니터링합니다. 용융 곡선은 하나의 앰플리콘의 존재를 확인하기 위해 특정 유전자에 대한 모든 샘플에서 단일 피크를 보여줍니다. 최적의 결과를 얻으려면 용융 곡선 프로토콜에서 단계 와 최소 보유 시간 사이에 섭씨 0.5도의 온도 증분을 사용합니다.
그런 다음 정량화 데이터 탭을 클릭하여 각 샘플에 대한 정량적 주기를 얻고 데이터를 스프레드시트로 내보내 추가 정량화 분석을 합니다. 인간 혈청 샘플은 세 가지 다른 그룹으로 분류될 수 있다: 뎅기열 바이러스 감염 확인 샘플, 뎅기열 바이러스 항체 확인 샘플, 그리고 뎅기열 바이러스가 항체 또는 RNA를 중화하지 않는 건강한 세라. 감염 48 시간 후, QRTPCR 분석은 뎅기열 바이러스 혈청형을 포함하는 대부분의 혈청이 다른 수준에서 Zika 바이러스 복제를 향상시킬 수 있음을 보여줍니다.
Zika 바이러스 titres에서 가장 높은 증가는 체증을 함유하는 뎅기열 바이러스 혈청형으로 처리된 대식세포에서 발견되며, 이는 체형 1및 3에 비해 Zika 바이러스의 상대적으로 낮은 유도를 보여준다. 멸균 환경을 유지하고, 적절한 개인 보호 장비를 착용하고, 항상 해동된 바이러스 혈청 샘플과 QPCR 시약을 얼음에 보관하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 쉽게 환자 혈청의 패널을 사용하여 황열병 바이러스, 뎅기열 바이러스 또는 웨스트 나일 바이러스와 같은 다른 flavivirus의 항체 의존적 향상을 연구하기 위해 수정될 수 있다.
이 기술은 arbovirus 또는 바이러스학 필드에 있는 미래 항체 의존적인 향상 연구 결과를 수행하는 데 매우 유용할 것입니다. 적절한 생체 안전 수준 2 개의 개인 보호 장비는 항상 사용되어야하며 모든 바이러스 성 폐기물은 폐기 하기 전에 30 분 동안 10 %의 표백제에서 오염제거해야합니다.
