Diese Methode kann verwendet werden, um die Auswirkungen der bereits bestehenden Immunität gegen Dengue-Virus auf Zika-Virus-Infektion zu bewerten, mit tatsächlichen menschlichen Patienten serum und primäre menschliche Immunzellen. Die Verwendung von tatsächlichen menschlichen Patientenserumproben und menschlichen Primärzellen bietet tiefere Einblicke in die Antikörperabhängige Verbesserung des Zika-Virus durch präimmunistische Seren und Antikörper. Diese Methode bietet Einblick in die Fähigkeit von Antikörpern im Blut eines Patienten, eine Virusinfektion in anderen menschlichen Zellen zu verbessern.
Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Virusinfektionsniveaus hoch genug für die Erkennung sind, aber niedrig genug, um die Zellen nicht zu überwältigen oder die Dateninterpretation zu stören. Beginnen Sie mit der Aussaat dreimal zehn bis vier Zellen in 100 Mikroliter Zellkultur Medium pro Brunnen in einer sterilen, flachen unteren 96-Well-Platte. Wenn alle Zellen plattiert sind, legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator und machen 10-fache serielle Verdünnungen von aufgetauten menschlichen Serumproben in Serum-freien Medium.
Achten Sie darauf, die Serumverdünnungen und Verdünnungsfaktor für alle präimmunen Seren konstant zu halten, bevor Sie die Verdünnungen zu den Viruslösungen und den Zellen hinzufügen. Als nächstes belastet das Tauwetter das Zika-Virus die Stammlösung in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für ein bis zwei Minuten, bevor der Bestand schnell auf Eis übertragen wird. Fügen Sie dem Serum aliquots eine 0,1-Multiplikation des Infektionsäquivalents des Zika-Virus hinzu und legen Sie die Platte für eine Stunde in den Zellkultur-Inkubator, damit die Dengue-Virus-Antikörper komplexe Komplexe mit den Zika-Virionen bilden können.
Am Ende der Inkubation die Zellen mit 100 Mikroliter PBS pro Brunnen waschen und jeweils 50 Mikroliter Immunkomplex zu jedem Brunnen hinzufügen. Nach der zweistündigen Inkubation das Medium entfernen und die Brunnen zweimal mit 100 MikroliterPBS pro Brunnen waschen, um die Immunkomplexe und alle ungebundenen Virionen vollständig zu entfernen. Dann füttern Sie die Zellen mit 100 Mikroliter pro Brunnen der Zellkultur Medium ergänzt mit 10%fetalen Rinderserum.
Dann geben Sie die Zellen für 48 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück. Zwei Tage nach der Infektion, waschen Sie die Zellen zweimal mit 100 Mikroliter sterilen PBS pro Brunnen, bevor Sie 250 Mikroliter Zelllysepuffer mit 10%beta Mercaptoethanol zu jedem Brunnen hinzufügen. Pipette mindestens fünfmal mit Kratzern nach oben und unten, um den Lyseprozess zu beschleunigen und die Zelllysate in sterile, beschriftete 1,5-Milliliter-Rohre zu übertragen.
Fügen Sie jedem Rohr und jeder Pipette ein gleiches Volumen von 70% Ethanol hinzu und geben Sie die Lysatlösung vier- bis fünfmal nach oben und unten. Wenn die Lysatsuspensionen klar sind, übertragen Sie jede Lösung in beschriftete Kieselsäuresäulen in zwei Milliliter-Sammelrohren für die Zentrifugation. Entsorgen Sie den Durchfluss, bei dem die Spalten in den gleichen Sammelrohren gehalten werden, und fügen Sie 700 Mikroliter Waschpuffer 1 zu jeder Spalte für eine zweite Zentrifugation hinzu.
Nach dem Wegwerfen des Durchflusses spülen Sie die Säulen noch zwei Mal mit 500 Mikroliter Waschpuffer zwei pro Wäsche ab. Nach der zweiten Wäsche die Säulen für eine weitere Zentrifugation in neue Zwei-Milliliter-Sammelrohre übertragen. Fügen Sie 30 Mikroliter 42 Grad Celsius RNasefreies Wasser in die Mitte jeder Säule für die Zentrifugation und die eluierte RNA wieder.
Für quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion oder QRTPCR-Analyse fügen Sie einen Mikroliter genspezifischer Vorwärts- und Reverse-Primer aus 10 Mikromolaren-Beständen zusammen mit 0,25 Mikroliter Reverse-Transkriptase-Mix pro Reaktion hinzu. Beachten Sie, dass Primer, die genetisches Material des Zika-Virus erkennen, virale Gene erkennen und eine Infektionsquantifizierung ermöglichen. Als nächstes fügen Sie 12,5 Mikroliter SYBR Green Mix hinzu, gefolgt von 25 Mikroliter Wasser zu jeder Reaktion, die 15 Mikroliter Master Mix in jedem Brunnen der 96-Well-QPCR-Platte hinzufügt.
Wenn Sie einen Master Mix verwenden, fügen Sie 100 Nanogramm der RNA-Probe in die Mischung ein und pipetteden Sie den Master Mix in einzelne Brunnen der QRTPCR-Platte. Beachten Sie, dass Proben in dreifacher Ausführung auf derselben QRTPCR-Platte ausgeführt werden sollten. Führen Sie dann die Proben auf einer quantitativen PCR-Maschine gemäß den in der Tabelle beschriebenen Parametern aus.
Klicken Sie in der Systemsoftware auf die Registerkarte Schmelzekurve, um die Schmelzekurve zu überwachen. Die Schmelzekurve zeigt einen einzigen Peak in allen Proben für ein bestimmtes Gen, um das Vorhandensein von nur einem Amplikon zu bestätigen. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie 0,5 Grad Celsius Temperaturschritte zwischen den Schritten und eine Mindesthaltezeit von 10 Sekunden im Schmelzkurvenprotokoll.
Klicken Sie dann auf die Registerkarte Quantifizierungsdaten, um einen quantitativen Zyklus für jede Stichprobe zu erhalten, und exportieren Sie die Daten zur weiteren Quantifizierungsanalyse in eine Kalkulationstabelle. Die humanen Serumproben können in drei verschiedene Gruppen eingeteilt werden: Dengue-Virus-Infektion bestätigte Proben, Dengue-Virus-Antikörper bestätigte Proben und gesunde Seren ohne Dengue-Virus neutralisierenantikörper oder RNA. Nach 48 Stunden Infektion zeigt die QRTPCR-Analyse, dass die meisten Seren, die Dengue-Virus-Serotyp eins bis vier Antikörper enthalten, in der Lage sind, die Zika-Virusreplikation auf verschiedenen Ebenen zu verbessern.
Der höchste Anstieg der Zika-Virus-Titres findet sich in Makrophagen, die mit dem Sera-haltigen Dengue-Virus Serotyp Serotyp zwei und vier Antikörper behandelt werden, verglichen mit Serotyp eins und drei, die eine relativ geringere Induktion des Zika-Virus aufweisen. Es ist wichtig, eine sterile Umgebung zu erhalten, die richtige persönliche Schutzausrüstung zu tragen und die aufgetauten Virusserumproben und QPCR-Reagenzien immer auf Eis zu halten. Dieses Protokoll kann leicht geändert werden, um Antikörper-abhängige Verbesserung anderer Flaviviren wie Gelbfiebervirus, Dengue-Virus oder West-Nil-Virus mit einem Panel von Patientenserum zu untersuchen.
Diese Technik wird sehr nützlich für die Durchführung zukünftiger antikörperabhängiger Verbesserungsstudien in den Bereichen Arbovirus oder Virologie sein. Die richtige Biosicherheitsstufe zwei persönliche Schutzausrüstungen sollten jederzeit verwendet werden, und alle viralen Abfälle sollten 30 Minuten vor der Entsorgung in 10 % Bleichmittel dekontaminiert werden.
