この方法は、実際のヒト患者血清および原発性ヒト免疫細胞を用いて、デング熱ウイルスに対する既存の免疫がジカウイルス感染に及ぼす影響を評価するために使用することができる。実際のヒト患者血清サンプルおよびヒト初代細胞の使用は、免疫前血清および抗体によるジカウイルスの抗体依存性増強に関するより深い洞察を提供する。この方法は、他のヒト細胞におけるウイルス感染を増強する患者の血液内の抗体の能力に関する洞察を提供する。
ウイルス感染レベルが検出に十分高いが、細胞を圧倒したり、データ解釈を妨げないように十分に低いことを確認することが重要です。滅菌された平らな底96ウェルプレートで、1ウェル当たり100マイクロリットルの細胞培養培地で30〜4番目の細胞を播種することから始めます。すべての細胞がめっきされたら、プレートを摂氏37度と5%の二酸化炭素インキュベーターに入れ、解凍したヒト血清サンプルの10倍の連続希釈液を血清フリー培地に入れます。
ウイルス溶液および細胞に希釈液を添加する前に、すべての免疫前血清の血清希釈および希釈因子を一定に保つようにしてください。次に、ジカウイルスは、すぐに氷にストックを転送する前に、1〜2分間37°Cの水浴でストック溶液を解凍します。血清アリコートにジカウイルスの感染等価量の0.1倍量を加え、細胞培養インキュベーターにプレートを1時間置き、デング熱ウイルス抗体がジカビリオンと複合体を形成できるようにする。
インキュベーションの終わりに、ウェルあたり100マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄し、各ウェルに50マイクロリットルの免疫複合体を加えます。2時間のインキュベーションの後、培地を取り除き、よく100マイクロリットルのPBSで井戸を2回洗い、免疫複合体と未接続のビリオンを完全に除去します。次に、10%のウシ胎児血清を添加した細胞培養培地のウェルあたり100マイクロリットルで細胞を供給する。
その後、細胞を48時間培養インキュベーターに戻す。感染の2日後、細胞を1ウェルあたり100マイクロリットルの無菌PBSで2回洗浄してから、各ウェルに10%βメルカプトエタノールを含む250マイクロリットルの細胞溶菌バッファーを添加する。ピペットは、リシスプロセスをスピードアップし、細胞ライセートを無菌標識1.5ミリリットルチューブに移すために、スクラッチで少なくとも5回上下します。
各チューブに70%エタノールの等量を加え、溶解液を上下に4〜5回ピペットします。溶解液懸濁液が明確な場合は、各溶液を2ミリリットルの回収チューブ内の標識されたシリカベースのカラムに移し、遠心分離を行います。フロースルーは、同じコレクションチューブ内の列を保持し、2番目の遠心のために各列に700マイクロリットルのウォッシュバッファ1を追加します。
フロースルーを廃棄した後、洗浄ごとに500マイクロリットルのウォッシュバッファを2回洗い流します。2回目の洗浄後、カラムを新しい2ミリリットルの回収チューブに移し、別の遠心分離を行います。遠心分離のために各カラムの中心に摂氏42度のRNaseフリー水の30マイクロリットルを加え、溶出したRNAを回収します。
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応またはQRTPCR分析では、10マイクロモル株の遺伝子特異的フォワードおよびリバースプライマーを1マイクロリットル加え、反応ごとに0.25マイクロリットルの逆転写酵素ミックスを加えます。ジカウイルス遺伝物質を認識するプライマーは、ウイルス遺伝子を検出し、感染定量を可能にする。次に、12.5マイクロリットルのSYBRグリーンミックスを加え、各反応に25マイクロリットルの水を加え、96ウェルQPCRプレートの各ウェルに15マイクロリットルのマスターミックスを加えます。
マスターミックスを使用する場合は、100ナノグラムのRNAサンプルをミックスに加え、マスターミックスをQRTPCRプレートの個々のウェルにピペットします。サンプルは、同じQRTPCRプレート上で三重に実行する必要があることに注意してください。次に、表に示したパラメータに従って定量PCRマシン上でサンプルを実行します。
システム ソフトウェアのメルト カーブ タブをクリックして、メルト カーブをモニタします。メルト曲線は、特定の遺伝子に対するすべてのサンプルにおいて単一のピークを示し、1つのアンプリコンの存在を確認する。最適な結果を得るには、融解曲線プロトコルで、ステップ間の0.5°Cの温度増分と最低保持時間10秒を使用してください。
次に、[定量データ]タブをクリックして各サンプルの定量サイクルを取得し、さらに定量分析のためにデータをスプレッドシートにエクスポートします。ヒト血清サンプルは、デングウイルス感染確認サンプル、デング熱ウイルス抗体確認サンプル、デング熱ウイルス中和抗体またはRNAのない健康血清の3つの異なるグループに分類することができます。48時間の感染後、QRTPCR分析は、デングウイルス血清型1〜4抗体を含むほとんどの血清が異なるレベルでジカウイルス複製を増強できることを示している。
ジカウイルスの価動体の最も高い増加は、ジカウイルスの比較的低い誘導を示す血清型1および3と比較して、血清含有デング熱ウイルス血清型2および4抗体で治療されたマクロファージに見られる。滅菌環境を維持し、適切な個人保護装置を着用し、融解されたウイルス血清サンプルとQPCR試薬を常に氷の上に保つことが重要です。このプロトコルは、患者血清のパネルを使用して、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、または西ナイルウイルスなどの他のフラビウイルスの抗体依存性増強を研究するために容易に改変することができる。
この技術は、アルボウイルスまたはウイルス学分野において、将来の抗体依存性増強研究を行う上で非常に有用である。適切なバイオセーフティレベル2つの個人保護装置は常に使用する必要があり、すべてのウイルス廃棄物は、廃棄前に30分間10%漂白剤で除染する必要があります。
