Bu yöntem, dang virüsüne karşı önceden var olan bağışıklığın Zika virüs enfeksiyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, gerçek insan hasta serumu ve birincil insan bağışıklık hücreleri kullanılarak kullanılabilir. Gerçek insan hasta serum örnekleri ve insan birincil hücrelerinin kullanımı ön-bağışıklık sera ve antikorlar tarafından Zika virüsü antikor bağımlı geliştirme içine daha derin bir fikir sağlar. Bu yöntem, diğer insan hücrelerinde bir virüs enfeksiyonu geliştirmek için bir hastanın kanında antikorların yeteneği içine fikir sağlar.
Viral enfeksiyon düzeylerinin tespit için yeterince yüksek ama hücreleri bunaltacak kadar düşük olduğundan veya veri yorumlanmasına müdahale edilemeyeceğini sağlamak önemlidir. Steril, düz alt 96-iyi plaka iyi başına hücre kültürü orta 100 mikrolitre dördüncü hücrelere üç kez on tohumlama ile başlayın. Tüm hücreler kaplandığında, tabağı 37 derece santigrat ve %5 karbondioksit inkübatöre yerleştirin ve çözülmüş insan serumu örneklerinin 10 kat seri seyreltilmesini serumsuz ortamda yapın.
Virüs çözümleri ve hücrelere seyreltme eklemeden önce tüm pre-immün serumlar için serum seyreltme ve seyreltme faktörü sabit tutmak için emin olun. Daha sonra, çözülme Zika virüsü, stokları hızla buza aktarmadan önce 37 derece lik bir su banyosunda 1-2 dakika santigrat derecede santigrat siler. Serum aliquots için Zika virüsü enfeksiyon eşdeğer hacmi 0.1 çokluk ekleyin ve dang virüsü antikorları Zika virions ile kompleksleri oluşturmak için izin vermek için bir saat boyunca hücre kültürü kuluçka plaka yerleştirin.
Kuluçka sonunda, iyi başına PBS 100 mikrolitre ile hücreleri yıkayın ve her kuyuya bağışıklık kompleksi 50 mikrolitre ekleyin. İki saatlik kuluçkadan sonra, orta yıkın ve tamamen bağışıklık kompleksleri ve herhangi bir bekar virions kaldırmak için iyi başına PBS 100 mikrolitre ile iki kez kuyuları yıkayın. Daha sonra hücre kültürü orta kuyu başına 100 mikrolitre ile hücreleri beslemek% 10 fetal sığır serum uymaktadır.
Sonra hücreleri 48 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Enfeksiyondan iki gün sonra, her kuyuya %10 beta mercaptoetanol ile 250 mikrolitre hücre lisis tamponu eklemeden önce hücreleri her biri 100 mikrolitre steril PBS ile iki kez yıkayın. Pipet, lysis işlemini hızlandırmak ve hücre lisatlarını steril etiketli 1,5 mililitrelik tüplere aktarmak için çizilme ile en az beş kez yukarı ve aşağı.
Her tüpe %70 etanol eşit hacim ekleyin ve lysat çözeltisini 4-5 kez yukarı ve aşağı inceleyip. Lysat süspansiyonları net olduğunda, santrifüj için iki mililitrelik toplama tüplerinde her çözeltiyi etiketli silika bazlı kolonlar halinde aktarın. Aynı toplama tüpleri sütunları tutarak akış atın ve ikinci bir santrifüj için her sütuna Wash Tampon 1 700 mikrolitre ekleyin.
Akış tan sonra, yıkama başına iki yıkama Tamponu 500 mikrolitre ile iki kez daha kolonları durulayın. İkinci yıkamadan sonra, başka bir santrifüj için yeni iki mililitrelik toplama tüpleri sütunaktarın. Santrifüj için her sütunun ortasına 42 derece RNase-Free su 30 mikrolitre ekleyin ve eluted RNA kurtarmak.
Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu veya QRTPCR analizi için 10 mikromolar stoktan bir mikrolitre gen spesifik ileri ve ters astarlar ve reaksiyon başına 0,25 mikrolitre ters transkriptaz karışımı ekleyin. Zika virüsü genetik materyalini tanıyan astarların viral genleri tespit edeceğini ve enfeksiyon nicelemesine olanak sağlayacağını unutmayın. Daha sonra, 96-well QPCR plaka her kuyuda Master Mix 15 mikrolitre ekleyerek her reaksiyona 25 mikrolitre su ardından SYBR Green Mix 12,5 mikrolitre ekleyin.
Master Mix kullanırken, Karışıma 100 nanogram RNA numunesi ekleyin ve Master Mix'i QRTPCR plakasının tek tek kuyularına pipetlendirin. Örneklerin aynı QRTPCR plakasında üç kat olarak çalıştırılması gerektiğini unutmayın. Daha sonra örnekleri tabloda belirtilen parametrelere göre nicel bir PCR makinesinde çalıştırın.
Erime eğrisini izlemek için sistem yazılımındaki erime eğrisi sekmesini tıklatma. Erime eğrisi, belirli bir genin sadece bir amplicon varlığını doğrulamak için tüm örneklerde tek tepe gösterecektir. Optimum sonuçlar için, erime eğrisi protokolünde adımlar arasında 0,5 derece sıcaklık artışları ve en az 10 saniye tutma süresi kullanın.
Ardından, her örnek için nicel bir döngü elde etmek ve daha fazla niceleme çözümlemesi için verileri bir elektronik tabloya aktarmak için niceleme veri sekmesini tıklatın. İnsan serum örnekleri üç farklı gruba kategorize edilebilir: dang virüsü enfeksiyonu doğrulanmış örnekler, dang virüsü antikor onaylı örnekler, ve hiçbir dang virüsü nötralize antikorlar veya RNA ile sağlıklı sera. 48 saatlik enfeksiyondan sonra QRTPCR analizi, dang virüsü içeren seraların çoğunun 1-4 antikor içeren seranın Zika virüsü replikasyonunu farklı seviyelerde geliştirebildiğini göstermektedir.
Zika virüs titres en yüksek artış zika virüsü nispeten daha düşük indüksiyon gösteren serotip bir ve üç göre sera içeren dang virüsü serotip iki ve dört antikorile tedavi makrofajlarda bulunur. Steril bir ortam sağlamak, uygun kişisel koruma ekipmanLarını takmak ve çözülmüş virüs serum örneklerini ve QPCR reaktiflerini her zaman buz üzerinde tutmak önemlidir. Bu protokol kolayca hasta serum bir panel kullanarak sarı humma virüsü, dang virüsü veya Batı Nil virüsü gibi diğer flavivirus antikor bağımlı geliştirme çalışma için değiştirilebilir.
Bu teknik, arbovirüs veya viroloji alanlarında gelecekteki antikora bağımlı geliştirme çalışmaları yürütmek için son derece yararlı olacaktır. Uygun biyogüvenlik seviyesi her zaman iki kişisel koruma ekipmanı kullanılmalı ve tüm viral atıklar imha edilmeden önce 30 dakika boyunca %10 çamaşır suyu yla dezenfekte edilmelidir.
