Этот метод может быть использован для оценки воздействия уже существующего иммунитета против вируса денге на инфекцию вируса Зика, используя реальную сыворотку человеческого пациента и первичные иммунные клетки человека. Использование фактических образцов сыворотки пациента человека и первичных клеток человека обеспечивает более глубокое понимание антител зависимого повышения вируса Зика предварительно иммунной сыворотки и антител. Этот метод дает представление о способности антител в крови пациента для повышения вирусной инфекции в других клетках человека.
Важно обеспечить, чтобы уровни вирусной инфекции были достаточно высокими для обнаружения, но достаточно низкими, чтобы не подавлять клетки или вмешиваться в интерпретацию данных. Начните с посева три раза десять четвертых клеток в 100 микролитров клеточной культуры среды на колодец в стерильной, плоской нижней 96-хорошо пластины. Когда все клетки были поцалены, поместите пластину в 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа инкубатор и сделать 10 раз серийных разбавления талых образцов человеческой сыворотки в сыворотке свободной среде.
Не забудьте сохранить разбавления сыворотки и фактор разбавления постоянным для всех предиммунные сыворотки, прежде чем добавлять разбавления вирусных растворов и клеток. Далее, оттепель вирус Зика штаммов фондовый раствор в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение одной-двух минут, прежде чем быстро передачи запасов на лед. Добавьте 0,1-кратность эквивалентного объема инфекции вируса Зика в алициты сыворотки и поместите пластину в инкубатор клеточной культуры в течение одного часа, чтобы антитела к вирусу денге образовы были сформировать комплексы с вирусами Зика.
В конце инкубации промыть клетки 100 микролитров PBS на колодец и добавить 50 микролитров иммунного комплекса к каждой хорошо. После двухчасовой инкубации удалите среду и дважды промойте колодцы 100 микролитров PBS на скважину, чтобы полностью удалить иммунные комплексы и любые непривязанные вирионы. Затем кормите клетки 100 микролитров на колодец клеточной культуры среды, дополненной 10%фетальной сывороткой крупного рогатого скота.
Затем верните клетки в инкубатор клеточной культуры на 48 часов. Через два дня после заражения, мыть клетки два раза с 100 микролитров стерильных PBS за колодец, прежде чем добавить 250 микролитров буфера лиза клеток с 10%бета меркаптоэтанол для каждой хорошо. Pipette вверх и вниз, по крайней мере пять раз с царапинами, чтобы ускорить процесс лиза и передачи лизайтов клетки стерильных помечены 1,5 миллилитров труб.
Добавьте равный объем 70% этанола к каждой трубке и пипетке лизировать раствор вверх и вниз четыре-пять раз. Когда лисовые суспензии ясны, перенесите каждый раствор в помеченные колонки на основе кремнезема в двух миллилитровых трубках для центрифугации. Откажитесь от сквозного хранения столбцов в тех же трубках коллекции и добавьте 700 микролитров Wash Buffer 1 к каждой колонке для второй центрифугации.
После отбрасывания протека, промыть столбцы еще два раза с 500 микролитров мытья буфера два за стирку. После второй стирки перенесите колонны на новые две миллилитровые трубки для другой центрифугации. Добавьте 30 микролитров воды 42 градусов по Цельсию RNase-Free в центр каждой колонки для центрифугации и восстановите надутую РНК.
Для количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени или анализа ЗРТКР добавьте один микролитр гена, специфичный вперед и обратной грунтовки из 10 микромоляных запасов, а также 0,25 микролитров смеси обратной транскриптазы на реакцию. Обратите внимание, что праймеры, которые распознают генетический материал вируса Зика, будут обнаруживать вирусные гены и позволят количественно оценить инфекцию. Далее добавьте 12,5 микролитров SYBR Green Mix, а затем 25 микролитров воды к каждой реакции, добавив 15 микролитров Master Mix в каждой пластине 96-хорошо.
При использовании Master Mix добавьте 100 нанограммов образца РНК в смесь и пипетку Master Mix в отдельные скважины пластины ЗРТПКР. Обратите внимание, что образцы должны быть запущены в тройном на той же пластине RTPCR. Затем запустите образцы на количественной машине ПЦР в соответствии с параметрами, изложенными в таблице.
Нажатие вкладки кривой расплава в программном обеспечении системы для мониторинга кривой расплава. Кривая расплава покажет один пик во всех образцах для конкретного гена, чтобы подтвердить наличие только одного ампликона. Для достижения оптимальных результатов используйте приращения температуры 0,5 градуса Цельсия между ступенями и минимальное время времени 10 секунд в протоколе кривой расплава.
Затем нажмите на вкладку данных количественной оценки, чтобы получить количественный цикл для каждой выборки и экспортировать данные в электронную таблицу для дальнейшего количественного анализа. Образцы сыворотки человека можно классифицировать по трем различным группам: подтвержденные образцы инфекции вируса денге, антитела вируса денге и здоровые сыворотки без вируса денге, нейтрализующие антитела или РНК. После 48 часов инфицирования анализ РТПКР показывает, что большинство сер, содержащих серотип вируса денге, способны усилить репликацию вируса Зика на различных уровнях.
Наибольшее увеличение числа титров вируса Зика содержится в макрофагах, обработанных серотипом вируса денге, содержащим серотип двух и четырех антител по сравнению с серотипом 1 и 3, которые показывают относительно более низкую индукцию вируса Зика. Важно поддерживать стерильную среду, носить надлежащее оборудование для личной защиты, а также всегда хранить на льду образцы сыворотки с размороженным вирусом и реагенты ПЦР. Этот протокол можно легко модифицировать для изучения антител-зависимого повышения других флавивирусов, таких как вирус желтой лихорадки, вирус денге или вирус Западного Нила с помощью панели сыворотки пациента.
Этот метод будет весьма полезен для проведения будущих антител-зависимых исследований повышения в арбовирусной или вирусологии областях. Правильная биобезопасность уровня два личной защиты оборудования должны быть использованы в любой момент, и все вирусные отходы должны быть обеззаражены в 10%bleach в течение 30 минут до удаления.
