שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום האימונותרפיה על הערכת ציטוטוקסיות תאים חיסוניים נגד תאים סרטניים מבנה 3D. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם שהיא פשוטה והיא משלבת טכנולוגיית הדמיה מתקדמת וראיה אימונולוגית רגישה. התחל על ידי שטיפת קו התאים סרטן המעי הגס של עניין עם חמישה מיליליטר של PBS והסרת התאים מתחתית הבקבוק עם 0.5 מיליליטר של טריפסין במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר אישור ניתוק תחת מיקרוסקופ, לנטרל את האנזים דיסוציאציה התא עם 10 מיליליטר של מדיום מלא לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. תן שימוש חוזר את גלולה בחמישה מיליליטר של מדיום שלם טרי לספירה לשימוש חוזר את התאים ב 1.5 פעמים 10 לתאים השלישי לריכוז מיליליטר. ואז לזרוע 200 microliters של תאים לתוך כל באר של צלחת תחתונה עגולה 96 היטב למקם את הצלחת ב מנגנון הדמיה אוטומטי בתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ו 95% לחות.
היכנס לתוכנת הרכישה של המנגנון ובחר לוח זמנים לרכישה, הפעלת הוספת כלי שיט, סריקה לפי לוח זמנים וצור כלי חדש. לאחר מכן, בחר סוג סריקה Spheroid ובחר את הערוצים המתאימים של שדה בהיר ו פלואורסצנטיות מעניינים. הגדר את ההגדלה ל-10 פעמים ובחר את דגם הלוח ואת מיקומו בתוך מגירת מנגנון ההדמיה.
בחר את מיקום בארות ההדמיה והזן את תיאור הניסוי כולל השם, סוג התאים ומספר התאים. עבור כיוונון הניתוח, בחר דחה ניתוח עד מאוחר יותר, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ציר הזמן ובחר הגדר מרווח זמן של קבוצת סריקה שנבחרה והגדר את הוסף סריקות כל ארבע שעות ובסך הכל עד 24 שעות. לאחר מכן להגדיר את זמן ההתחלה לפחות שעה אחת לאחר הדגירה במנגנוני הדמיה אוטומטית.
כדי לבדוק את התקדמות הצמיחה הכדורית, כל יומיים, היכנס לתוכנת ההדמיה ובחר הצג סריקות אחרונים. לחצו פעמיים על ניסוי העניין ובחרו Brightfield בחלונית 'ערוצי תמונה'. לאחר מכן השתמש בכלי מדידת תכונות תמונה כדי למדוד את קוטר הספרואידים, והוסיף 50 מיקרוליטרים של מדיום שלם ל באר ביום הרביעי כדי להגביל את כל השפעות האידוי הבינוניות.
כאשר הכדורואידים מגיעים לגודל הניסיוני המתאים, זווית בזהירות את הצלחת ולהשתמש פיפטה רב ערוצית בעדינות להסיר 150 microliters של מדיום שלם מכל באר מבלי להפריע כדורידים. לאחר מכן, החלף את המדיום שהושלך עם 50 microliters של פתרון אחד עד 200 של Annexin V אדום ולה מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך 15 דקות. צנטריפוגה מתמר CAR CD19 T תאים בצינור חרוט 15 מיליליטר ו resuspend גלולה בשני מיליליטר של מדיום שלם.
לאחר הספירה, לדלל את התאים פעמיים 10 לתאים החמישיים למיליליטר של ריכוז בינוני מלא. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תאי CAR CD19 T לכל באר המכילה כדורית והחזירו את הלוחית למנגנוני ההדמיה האוטומטיים. בתוכנת הרכישה, בחר לוח זמנים לרכישה ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ציר הזמן של הסריקה.
בחר ערוך ציר זמן ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על קבוצת הסריקה כדי למחוק אותו. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ציר הזמן שוב ובחר הגדר מרווח קבוצת סריקה שנבחר והגדר את הוסף סריקות כל 1 1/2 שעות ובסך הכל עד 24 שעות. לאחר מכן הגדר את שעת ההתחלה של ההדמיה לשעה אחת לפחות לאחר תחילת הדגירה במנגנוני ההדמיה האוטומטיים ובחר שמור סריקות לוח זמנים.
לניתוח תמונה אוטומטי, בתוכנת הסריקה, בחרו 'הצג סריקות אחרונים' ו'ניתוח הפעלה'. בחרו 'צור סוג ניתוח וניתוח חדש' Spheroid והגדירו את ערוצי התמונה לניתוח. בחרו לפחות 10 תמונות מייצגות ותצוגה מקדימה של הליך הניתוח המוגדר כברירת מחדל בכל ערימת התמונות.
שנה את הפרמטרים עבור מסיכת השדה הבהיר והצג בתצוגה מקדימה את מחסנית התמונות, ואשר שהפרמטרים שנבחרו מזהים את הכדורואידים במדויק. שנה את הפרמטרים עבור מסיכה ירוקה והצג בתצוגה מקדימה את מחסנית התמונות כדי לאשר שהפרמטרים שנבחרו מזהים את הספרואידים במדויק. שנה את הפרמטרים עבור מסיכה אדומה והצג בתצוגה מקדימה את מחסנית התמונות כדי לאשר שהפרמטרים שנבחרו מזהים את הכדורואידים במדויק.
יש לדאוג להשיג את האות הטוב ביותר על פני רעש ורגישות על פני יחסי ספציפיות, תוך שמירה על כך שלא תוכל למצוא קבוצה של פרמטרים המאפשרים ללכוד כל אירוע בכל נקודת זמן. אז תשגר את המנתח. לאחר השלמת הניתוח, חלץ את מדידת העניין ובחר את הקובץ שנותח ואת האפשרות מדדי גרף.
בחר את מדדי העניין, הסריקה וה באר. לחץ על יצא נתונים כדי לחלץ את המדדים שנבחרו במספר תבניות קובץ. לאחר מכן, כדי לחלץ את התמונות, בחרו בקובץ שנותח ובחרו 'ייצוא תמונות וסרטים'.
ביטוי CD19 CAR על תאי T מתומרים וביטוי CD19 על תאים סרטניים המעי הגס מתומרים ניתן לאשר על ידי ציטומטריית זרימה. כאן, ניתן לראות את התוצאה של ניסוי כדורי טיפוסי. שלא כמו תאי T מדומים, תאי CD19 CAR T מסוגלים להרוג באופן ספציפי את כדוריות הכדורידים שמקורן בקו התאים המעי הגס, מה שמקטין מאוד את מספר תאי הגידול החיים.
מעקב אחר האבולוציה של האותות הירוקים והאדום הכוללים בתוך גבולות הכדוריד לאורך זמן מגלה כי זמן קצר לאחר הזרקת תא CD19 CAR T, גודל הכדורואידים מתכווץ במהירות ככל שאות האפופטוזיס גדל במהירות. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו בדיקות רעילות, בדיקות הגירת תאים, או מדידות מבנה ספרואיד יכול להתבצע כדי לענות על שאלות נוספות על הקרנת סמים, תנועתיות תא T, או היווצרות ספרואיד, בהתאמה.
