一种用汽车 t 细胞进行的切杀检测

该方法有助于回答免疫治疗领域对三D结构肿瘤细胞免疫细胞毒性评价的关键问题。这种方法的主要优点是简单明了，它结合了先进的成像技术和敏感的免疫测定。首先用5毫升PBS清洗感兴趣的结肠直肠癌细胞系，并在37摄氏度下用0.5毫升的尝试性药物从烧瓶底部取出细胞，5分钟。

在显微镜下确认分离后，用10毫升完整培养基中和细胞分离酶，通过离心收集细胞。将颗粒以5毫升新鲜完整介质重新浓缩，以每毫升浓度1.5倍至第三细胞的1.5倍重新产生细胞。然后将200微升细胞播种到96井圆底板的每个井中，将该细胞放入37摄氏度的培养箱内，其CO2和95%湿度为25%。

登录到设备购置软件，并选择获取计划、启动添加容器、按计划扫描和创建新容器。接下来，选择扫描类型 Spheroid，并选择感兴趣的适当亮场和荧光通道。将放大倍数设置为 10 倍，然后选择板模型及其在成像设备抽屉中的位置。

选择要成像的井的位置，并输入实验的描述，包括名称、单元格类型和单元格数。对于分析设置，选择"延迟分析直到以后"，右键单击时间线，然后选择"设置选定的扫描组间隔"，并将"每 4 小时添加扫描"设置为"每 4 小时添加一次扫描"，将"总计"设置为 24 小时。然后将开始时间设置为在自动成像设备中孵育后至少一小时。

要检查球体生长进度，请每两天登录一次成像软件，然后选择"查看最近扫描"。双击感兴趣的实验，并在"图像通道"面板中选择"光明场"。然后使用测量图像特征工具测量球体的直径，在第四天每孔添加 50 微升全介质，以限制任何中等蒸发效果。

当球体达到适当的实验尺寸时，小心地对板进行角角，并使用多通道移液器从每一井轻轻取出 150 微升完整介质，而不会干扰球体。接下来，用附件五红色1至200溶液的50微升替换废弃的介质，将板放在细胞培养箱中15分钟。在15毫升锥形管中将 CAR CD19 T 细胞进行离心，将颗粒重新在两毫升的完整介质中。

计数后，将细胞稀释至每毫升完全中等浓度的2倍10至第5个细胞。然后将100微升的 CAR CD19 T细胞添加到每个含球类的井中，并将板返回自动成像设备。在采集软件中，选择"获取计划"，右键单击扫描时间线。

选择"编辑时间轴"并右键单击扫描组以将其删除。右键单击时间线，然后选择"设置选定的扫描组间隔"，并将"每添加扫描一次"设置为 1 个半小时，并将"总计"设置为 24 小时。然后将成像开始时间设置为在自动成像设备中开始孵育后至少一小时，然后选择"保存计划扫描"。

对于自动图像分析，请在扫描软件中选择"查看最近扫描和启动分析"。选择"创建新分析定义和分析类型"球体"，并设置要分析的图像通道。选择至少 10 个代表性图像，并预览整个图像堆栈上的默认分析过程。

修改亮场蒙版参数并预览图像堆栈，确认所选参数可准确检测球体。修改绿色蒙版参数并预览图像堆栈，以确认所选参数准确检测球体。修改红色蒙版参数并预览图像堆栈，以确认所选参数准确检测球体。

注意实现最佳信号，而不是噪声和灵敏度，而不是特异性比，请记住，您将无法找到一组参数，允许捕获每个时间点的每个事件。然后启动分析器。分析完成后，提取兴趣度量并选择分析的文件和图形指标选项。

选择感兴趣的指标、扫描和井。单击"导出数据"以多种文件格式提取所选指标。然后，要提取图像，请选择分析的文件，然后选择导出图像和影片。

转导T细胞上的CD19 CAR表达和转导结肠直肠癌上的CD19表达可以通过流式细胞学进行确认。在这里，可以观察到典型的球体实验的结果。与模拟T细胞不同，CD19 CAR T细胞能够专门杀死结肠直肠癌细胞系衍生的球状细胞，大大减少活肿瘤细胞的数量。

跟踪球形边界内绿色和红色信号随时间变化的跟踪表明，在CD19 CAR T细胞注射后不久，球体的大小会随着凋亡信号的迅速增加而迅速缩小。按照这个程序，还可以执行其他方法，如毒性测定、细胞迁移测定或球体结构测量，分别回答有关药物筛选、T细胞动能或球体形成的其他问题。