Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Immuntherapie über die Beurteilung der Immunzellzytotoxizität gegen 3D-Strukturtumorzellen zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Methode sind, dass sie einfach ist und fortschrittliche Bildgebungstechnologie und einen empfindlichen immunologischen Test kombiniert. Beginnen Sie mit dem Waschen der darmen Krebszelllinie von Interesse mit fünf Milliliter PBS und entfernen Sie die Zellen aus dem Kolbenboden mit 0,5 Milliliter Trypsin für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.
Nach der Bestätigung der Ablösung unter dem Mikroskop neutralisieren Sie das Zelldissoziationsenzym mit 10 Millilitern des kompletten Mediums und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Setzen Sie das Pellet in fünf Milliliter frisches komplettes Medium für das Zählen aus und setzen Sie die Zellen bei einer 1,5-mal 10-bis-dritten Zelle pro Milliliter-Konzentration wieder aus. Dann säen Sie 200 Mikroliter Zellen in jeden Brunnen der 96-well runden Bodenplatte und legen Sie die Platte in einem automatisierten Bildgebungsgerät in einem 37 Grad Celsius Inkubator mit 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit.
Melden Sie sich bei der Erfassungssoftware des Geräts an und wählen Sie Schedule to Acquire, Launch Add Vessel, Scan on Schedule und Create Vessel New aus. Wählen Sie als Nächstes den Scantyp Spheroid aus und wählen Sie die entsprechenden Hellenfeld- und Fluoreszenzkanäle aus. Stellen Sie die Vergrößerung auf das 10-fache ein und wählen Sie das Plattenmodell und seine Position in der Schublade des Bildgeräts aus.
Wählen Sie die Position der zu bebildernden Bohrungen aus, und geben Sie die Beschreibung des Experiments ein, einschließlich name, Zelltyp und Anzahl der Zellen. Wählen Sie für die Analyseeinrichtung die Option Analyse bis später verzögern aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Zeitachse, und wählen Sie Ausgewähltes Scangruppenintervall festlegen aus, und legen Sie Scans alle bis vier Stunden und insgesamt bis 24 Stunden hinzu. Stellen Sie dann die Startzeit mindestens eine Stunde nach der Inkubation im automatisierten Bildgebungsgerät ein.
Um den Sphäroid-Wachstumsfortschritt zu überprüfen, melden Sie sich alle zwei Tage bei der Bildverarbeitungssoftware an und wählen Sie Aktuelle Scans anzeigen aus. Doppelklicken Sie auf das Experiment von Interesse und wählen Sie Brightfield im Bildkanal-Bedienfeld aus. Verwenden Sie dann das Werkzeug Bild-Features messen, um den Durchmesser der Sphäroide zu messen, und fügen Sie 50 Mikroliter des gesamten Mediums pro Brunnen an Tag vier hinzu, um alle mittleren Verdunstungseffekte zu begrenzen.
Wenn die Sphäroide die entsprechende experimentelle Größe erreichen, winkeln Sie die Platte sorgfältig an und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 150 Mikroliter komplettes Medium aus jedem Brunnen sanft zu entfernen, ohne die Sphäroide zu stören. Als nächstes ersetzen Sie das ausrangierte Medium durch 50 Mikroliter einer einbis 200 Lösung von Annexin V Red und legen Sie die Platte für 15 Minuten in einen Zellkultur-Inkubator. Zentrifuge transduzierte CAR CD19 T-Zellen in einem 15 Milliliter konischen Rohr und setzen das Pellet in zwei Millilitern des kompletten Mediums wieder auf.
Nach dem Zählen die Zellen auf zwei mal 10 bis fünf Liter pro Milliliter vollständiger mittlerer Konzentration verdünnen. Dann fügen Sie 100 Mikroliter CAR CD19 T-Zellen zu jedem sphäroidhaltigen Brunnen hinzu und geben Sie die Platte an das automatisierte Bildgebungsgerät zurück. Wählen Sie in der Erfassungssoftware "Zu erwerben planen" aus, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Scan-Timeline.
Wählen Sie Zeitleiste bearbeiten aus, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Scangruppe, um sie zu löschen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste erneut auf die Zeitleiste und wählen Sie Ausgewähltes Scangruppenintervall festlegen aus und legen Sie Scans alle auf 1 1/2 Stunden und für insgesamt bis zu 24 Stunden fest. Stellen Sie dann die Bildstartzeit auf mindestens eine Stunde nach Beginn der Inkubation im automatisierten Bildverarbeitungsgerät ein und wählen Sie Schedule Scans speichern aus.
Für die automatisierte Bildanalyse wählen Sie in der Scansoftware Aktuelle Scans anzeigen und Analyse starten aus. Wählen Sie Neue Analysedefinition und Analysetyp Spheroid erstellen aus, und legen Sie die zu analysierenden Bildkanäle fest. Wählen Sie mindestens 10 repräsentative Bilder aus, und zeigen Sie eine Vorschau des standardmäßigen Analyseverfahrens für den gesamten Bildstapel an.
Ändern Sie die Parameter für die Hellfeldmaske, und zeigen Sie eine Vorschau des Bildstapels an, um zu bestätigen, dass die ausgewählten Parameter die Sphäroide genau erkennen. Ändern Sie die Parameter für die grüne Maske, und zeigen Sie eine Vorschau des Bildstapels an, um zu bestätigen, dass die ausgewählten Parameter die Sphäroide genau erkennen. Ändern Sie die Parameter für die rote Maske, und zeigen Sie eine Vorschau des Bildstapels an, um zu bestätigen, dass die ausgewählten Parameter die Sphäroide genau erkennen.
Achten Sie darauf, das beste Signal über Rauschen und Empfindlichkeit über Spezifitätsverhältnisse zu erreichen, wobei Sie bedenken, dass Sie nicht in der Lage sein werden, eine Reihe von Parametern zu finden, die es ermöglichen, jedes Ereignis zu jedem Zeitpunkt zu erfassen. Starten Sie dann den Analyzer. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, extrahieren Sie die Messung des Interesses, und wählen Sie die analysierte Datei und die Option Diagrammmetriken aus.
Wählen Sie die gewünschten Metriken, den Scan und den Brunnen aus. Klicken Sie auf Daten exportieren, um die ausgewählten Metriken in verschiedenen Dateiformaten zu extrahieren. Um die Bilder zu extrahieren, wählen Sie dann die analysierte Datei aus und wählen Sie Bilder und Filme exportieren aus.
CD19 CAR-Expression auf transduzierten T-Zellen und CD19-Expression auf transduzierten Darmkrebszellen können durch Durchflusszytometrie bestätigt werden. Hier kann das Ergebnis eines typischen Sphäroidexperiments beobachtet werden. Im Gegensatz zu Mock-T-Zellen sind CD19 CAR T-Zellen in der Lage, die von Darmkrebszellabgeleiteten Sphäroide gezielt abzutöten, was die Anzahl der lebenden Tumorzellen stark verringert.
Die Verfolgung der Entwicklung der gesamten grünen und roten Signale innerhalb der Sphäroidgrenzen im Laufe der Zeit zeigt, dass kurz nach cd19 CAR T Zellinjektion, die Größe der Sphäroide schrumpft schnell, wie die Apoptose-Signal schnell erhöht. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Toxizitätstests, Zellmigrationstests oder Sphäroidstrukturmessungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zum Arzneimittelscreening, zur T-Zell-Motilität bzw. zur Sphäroidbildung zu beantworten.
