이 방법은 3D 구조 종양 세포에 대한 면역 세포 세포 독성의 평가에 대한 면역 요법 분야에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 간단하고 고급 이미징 기술과 민감한 면역 학적 분석법을 결합한다는 것입니다. PBS의 5 밀리리터로 관심있는 대장암 세포 라인을 세척하고 섭씨 37도에서 5 분 동안 트립신의 0.5 밀리리터로 플라스크 바닥에서 세포를 제거합니다.
현미경으로 분리를 확인한 후, 완전한 배지의 10 밀리리터로 세포 해리 효소를 중화시키고 원심분리에 의해 세포를 수집한다. 밀리리터 농도당 세 번째 세포에 1.5배 10회에서 세포를 재보일시 하여 셀을 계산하고 재중단하기 위해 5밀리리터의 신선한 완전 배지에서 펠릿을 다시 중단한다. 그런 다음 200 마이크로리터의 세포를 96웰 원형 바닥 플레이트의 각 우물로 시드하고 5%CO2 및 95%의 습도를 가진 37도 섭씨 인큐베이터 내부에 자동 이미징 장치에 플레이트를 배치합니다.
장치의 인수 소프트웨어에 로그인하고 획득 할 일정을 선택, 선박 추가 를 시작, 일정에 스캔하고, 선박 새 만들기. 다음으로, 스캔 유형 Spheroid를 선택하고 관심의 적절한 밝은 필드 및 형광 채널을 선택합니다. 배율을 10배로 설정하고 이미징 장치 서랍 내에서 플레이트 모델 과 그 위치를 선택한다.
이미지화할 우물의 위치를 선택하고 이름, 셀 유형 및 셀 수를 포함하는 실험의 설명을 입력합니다. 분석 설정의 경우 나중에 분석 연기를 선택하고 타임라인을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 선택한 스캔 그룹 간격 을 선택하고 스캔 추가를 4시간 마다 설정하고 총 24시간 동안 검색 추가를 설정합니다. 그런 다음 자동 이미징 장치에서 인큐베이션 후 적어도 1시간으로 시작 시간을 설정합니다.
스페로이드 성장 진행 상황을 확인하려면 2일마다 이미징 소프트웨어에 로그인하여 최근 스캔 보기를 선택합니다. 관심 있는 실험을 두 번 클릭하고 이미지 채널 패널에서 브라이트필드를 선택합니다. 그런 다음 측정 이미지 특징 도구를 사용하여 스페로이드의 직경을 측정하고, 4일째에 50마이크로리터의 완전한 배지를 추가하여 중간 증발 효과를 제한합니다.
스페로이드가 적절한 실험 크기에 도달하면 플레이트를 조심스럽게 각도로 조정하고 멀티 채널 파이펫을 사용하여 스페로이드를 방해하지 않고 각 우물에서 150 마이크로리터의 완전한 매체를 부드럽게 제거합니다. 다음으로, 버려진 배지를 1~200개의 부속서 V 레드용액의 50마이크로리터로 교체하고 15분 동안 세포 배양 배양배기에 플레이트를 배치한다. 원심분리기는 15밀리리터 원판 튜브에서 CAR CD19 T 세포를 변형시키고 완전한 배지의 2밀리리터로 펠릿을 재해석하였다.
계산 후, 완전한 중간 농도의 밀리리터 당 다섯 번째 세포에 2 회 10으로 세포를 희석. 그런 다음 CAR CD19 T 셀 100마이크로리터를 각 스페로이드 함유에 잘 추가하고 플레이트를 자동화된 이미징 장치로 되돌려 놓습니다. 획득 소프트웨어에서 획득 일정을 선택하고 스캔 타임라인을 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.
타임라인 편집을 선택하고 스캔 그룹을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 삭제합니다. 타임라인을 다시 클릭하고 선택한 스캔 그룹 간격 집합을 선택하고 스캔 추가를 1 1/2시간, 총 24시간 동안 설정합니다. 그런 다음 이미징 시작 시간을 자동화된 이미징 장치에서 인큐베이션이 시작된 후 최소 1시간으로 설정하고 일정 스캔 저장을 선택합니다.
자동화된 이미지 분석을 위해 스캔 소프트웨어에서 최근 검사 보기 및 시작 분석을 선택합니다. 새 분석 정의 및 분석 유형 Spheroid 만들기를 선택하고 분석할 이미지 채널을 설정합니다. 최소 10개의 대표 이미지를 선택하고 전체 이미지 스택에서 기본 분석 절차를 미리 봅타입니다.
밝은 필드 마스크의 매개 변수를 수정하고 이미지 스택을 미리 보고 선택한 매개 변수가 스페로이드를 정확하게 감지하는지 확인합니다. 녹색 마스크의 매개 변수를 수정하고 이미지 스택을 미리 보고 선택한 매개 변수가 스페로이드를 정확하게 감지하는지 확인합니다. 빨간색 마스크의 매개 변수를 수정하고 이미지 스택을 미리 보고 선택한 매개 변수가 스페로이드를 정확하게 감지하는지 확인합니다.
특이성 비율에 비해 노이즈와 감도에 대한 최상의 신호를 달성하기 위해 주의해야 하며, 매 지점에서 모든 이벤트를 캡처할 수 있는 매개 변수 집합을 찾을 수 없습니다. 그런 다음 분석기를 시작합니다. 분석이 완료되면 관심 측정을 추출하고 분석된 파일 및 그래프 메트릭 옵션을 선택합니다.
관심 있는 메트릭, 스캔 및 우물을 선택합니다. 데이터 내보내기를 클릭하여 선택한 메트릭을 여러 파일 형식으로 추출합니다. 그런 다음 이미지를 추출하려면 분석된 파일을 선택하고 이미지 및 영화 내보내기를 선택합니다.
CD19 CAR 발현은 트랜스포메이트 된 대장암세포에 대한 트랜스포메이트 T 세포 및 CD19 발현을 유동 세포측정에 의해 확인할 수 있다. 여기서, 전형적인 스페로이드 실험의 결과를 관찰할 수 있다. 모의 T 세포와 달리, CD19 CAR T 세포는 특히 대장암 세포 세포 세포 유래 스페로이드를 죽일 수 있으며, 살아있는 종양 세포의 수를 크게 감소시다.
시간이 지남에 따라 스페로이드 경계 내에서 전체 녹색 및 빨간색 신호의 진화를 추적하면 CD19 CAR T 세포 주입 직후, 세포 사멸 신호가 빠르게 증가함에 따라 스페로이드의 크기가 빠르게 축소된다는 것을 알 수 있습니다. 이 절차에 따라 독성 애세, 세포 이동 액세 또는 스페로이드 구조 측정과 같은 다른 방법은 약물 스크리닝, T 세포 운동성 또는 스페로이드 형성에 대한 추가 질문에 각각 답하기 위해 수행될 수 있다.
