この方法は、腫瘍細胞の3D構造に対する免疫細胞毒性の評価に関する免疫療法分野における重要な質問に答える助けとなる。この方法の主な利点は、それが簡単であり、高度なイメージング技術と敏感な免疫学的アッセイを組み合わせることです。PBSの5ミリリットルで関心のある大腸癌細胞株を洗浄し、37°Cで5分間0.5ミリリットルのトリプシンでフラスコ底から細胞を取り除くことから始めます。
顕微鏡で剥離を確認した後、完全な培地の10ミリリットルで細胞解離酵素を中和し、遠心分離によって細胞を収集する。ペレットをカウント用の新鮮な完全な培地の5ミリリットルに再懸濁し、ミリリットル濃度あたり3番目の細胞に1.5倍の10で細胞を再懸濁する。その後、200マイクロリットルの細胞を96ウェル丸底板の各ウェルに種分し、5%CO2と湿度95%の37°Cインキュベーター内の自動イメージング装置にプレートを入れる。
装置の取得ソフトウェアにログインし、取得するスケジュールを選択し、船舶の追加を開始し、スケジュールに従ってスキャンし、船舶を新規に作成します。次に、スキャンタイプのスフェロイドを選択し、目的の適切な明視野チャネルと蛍光チャネルを選択します。倍率を10倍に設定し、撮像装置の引き出し内のプレートモデルとその位置を選択します。
画像を作成するウェルの位置を選択し、名前、セルの種類、セル数などの実験の説明を入力します。分析の設定では、[後で分析を延期] を選択し、タイムラインを右クリックして[選択したスキャン グループ間隔を設定]を選択し、[スキャンの追加間隔] を [4 時間ごとに追加] と [合計 24 時間] に設定します。次に、自動撮像装置でインキュベーション後少なくとも1時間の開始時間を設定する。
回転楕円体の成長の進行状況を確認するには、2 日ごとにイメージング ソフトウェアにログインし、[最近のスキャンを表示] を選択します。目的の実験をダブルクリックし、画像チャンネルパネルで「ブライトフィールド」を選択します。次に、イメージフィーチャの測定ツールを使用して、スフェロイドの直径を測定し、4日目に井戸あたり50マイクロリットルの完全な媒体を追加して、媒体の蒸発効果を制限します。
回転楕円体が適切な実験サイズに達したら、プレートを慎重に角度を付け、マルチチャンネルピペットを使用して、スフェロイドを邪魔することなく、各ウェルから完全な媒体の150マイクロリットルを穏やかに除去します。次に、廃棄した培地を、アネキシンVレッドの1~200溶液の50マイクロリットルに交換し、15分間細胞培養インキュベーターにプレートを入れる。遠心分離機はCAR CD19 T細胞を15ミリリットル円錐形チューブにトランステーンし、完全な培地の2ミリリットルでペレットを再懸濁した。
計数後、完全な培地濃度のミリリットル当たり5番目の細胞に2倍10〜5番目の細胞に細胞を希釈する。次に、各スフェロイド含有ウェルにCAR CD19 T細胞100マイクロリットルを加え、プレートを自動画像化装置に戻します。取得ソフトウェアで、[取得するスケジュール] を選択し、スキャンタイムラインを右クリックします。
[タイムラインを編集]を選択し、スキャングループを右クリックして削除します。タイムラインをもう一度右クリックし、[選択したスキャングループ間隔を設定]を選択し、[スキャンを1時間半ごとに追加]と[合計24時間]に設定します。次に、自動イメージング装置でインキュベーション開始後少なくとも1時間経過してから、イメージング開始時刻を設定し、[スケジュールスキャンを保存]を選択します。
自動画像解析の場合、スキャン ソフトウェアで、[最近のスキャンを表示して分析を起動] を選択します。[新しい解析定義を作成]を選択し、解析するイメージ チャネルを設定します。10 以上の代表的な画像を選択し、イメージ スタック全体で既定の分析手順をプレビューします。
明視野マスクのパラメータを変更し、イメージスタックをプレビューして、選択したパラメータが回転楕円体を正確に検出することを確認します。緑色のマスクのパラメータを変更し、イメージ スタックをプレビューして、選択したパラメータが回転楕円体を正確に検出することを確認します。赤いマスクのパラメータを変更し、イメージ スタックをプレビューして、選択したパラメータが回転楕円体を正確に検出することを確認します。
ノイズと感度に対するノイズと感度に対する最高の信号を、各時点ですべてのイベントをキャプチャできるパラメータのセットを見つけることができないことを念頭に置いて、注意してください。次に、アナライザを起動します。分析が完了したら、対象の測定値を抽出し、分析されたファイルとグラフメトリックオプションを選択します。
対象のメトリック、スキャン、およびウェルを選択します。[データのエクスポート] をクリックして、選択したメトリックを複数のファイル形式で抽出します。次に、画像を抽出するには、解析対象のファイルを選択し、[イメージとムービーのエクスポート] を選択します。
トランスデューセドT細胞に対するCD19 CAR発現およびトランスデューセ型大腸癌細胞に対するCD19発現は、フローサイトメトリーにより確認できる。ここで、典型的なスフェロイド実験の結果が観察できる。模擬T細胞とは異なり、CD19 CAR T細胞は、結腸直腸癌細胞由来のスフェロイドを特異的に殺すことができるので、生きた腫瘍細胞の数を大幅に減少させる。
時間の経過に応じてスフェロイド境界内の合計緑と赤の信号の進化の追跡は、CD19 CAR T細胞注入の直後に、アポトーシス信号が急速に増加するにつれて、スフェロイドのサイズが急速に縮小することを明らかにします。この手順に従って、毒性アッセイ、細胞移動アッセイ、またはスフェロイド構造測定のような他の方法は、それぞれ薬物スクリーニング、T細胞運動性、またはスフェロイド形成に関する追加の質問に答えるために行うことができる。
