המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לשלב את השימוש במיקרו נוזלים עם מערכי מיקרו אלקטרודה כדי ליצור את הפלטפורמה המתאימה לחקר תקשורת עצבית והפצת אותות אקסונאליים. שלום, אני פאולו אגואר ואני PI של המעבדה להנדסת נוירו וחישוב מדעי המוח ב INEB, משמש קוד להנדסה ביו רפואית באוניברסיטת פורטו, פורטוגל. הבנת העברת מידע במעגלים עצביים נותרה אחד האתגרים הגדולים ביותר במדעי המוח.
היום, אני הולך להראות לך איך אנחנו יכולים לשלב מערכי מפעיל מיקרו בודדים עם מיקרו נוזלים וכלים תוכנה שפותחו כאן במעבדה שלנו, כדי לזהות ולאפיין פוטנציאל פעולה הפצה. אנו משתמשים בהתקנה זו במגוון מחקרים, כלומר קידוד ופענוח עצביים, ובתקשורת בין נוירונים חושיים וסוגי תאים אחרים. אנו מאמינים כי ההדגמה החזותית של פרוטוקול זה היא קריטית.
מאז הרכבת מערכי מיקרו נוזלי מיקרו אלקטרודה הוא קושי בניהול, וקשה לשחזר רק על ידי שכפול פרוטוקולים. עבור השוק, מכירות פולחן על פלטפורמה זו אינה פשוטה, כמו ABAs קונבנציונאלי, וזה דורש תשומת לב מיוחדת החומר יושב התא, מגנטים תרבות. התקנה זו מאפשרת לנו ללמוד מספר מאפיינים הקשורים לתקשורת, כגון מהירות התפשטות וכיוון, בסביבה מבוקרת היטב.
למרות שהליך ההקלטה הוא פשוט, ניתוח נתונים דורש ידע ושימוש בכלים החישוביים הנכונים. ביום שלפני הישיבה התא, להתחיל על ידי הכנת התקנים מיקרו נוזלים, על ידי ניקוי למטה עם קלטת ויניל. לחץ בעדינות על הקלטת כנגד ההתקן כדי להגיע לכל אזורי המיקרו-נוזלים.
פלזמת אוויר לנקות את MEA במשך שלוש דקות כדי לנקות את פני השטח ולהפוך אותו הידרופילי יותר. בתוך מכסה המנוע של זרימה למינארית, הטביעו את המיקרו-נוזלים באתנול של 70 אחוז. אפשר להם להתייבש באוויר.
מניחים כל MEA בצלחת פטרי, ו לעקר על ידי 15 דקות של חשיפה לאור UV. לאחר מכן, עבור לאזור המרכזי של MEA עם 500 מיקרוליטרים של פתרון PEI. דגירה לפחות שעה אחת.
בתוך מכסה המנוע לזרימת למינאר, שאף את פתרון ציפוי ה- PEI מפני השטח של MEA. לאחר מכן, לשטוף את MEAs ארבע פעמים עם מיליליטר אחד של מים סטריליים. בעזרת מיקרוסקופ סטרילי, ממוקם בתוך מכסה המנוע לזרימת למינאר.
מרכז את שבב MEA, ולהוסיף מיליליטר אחד של מים סטריליים לאזור המרכזי של MEA. לאחר מכן, מקם את ההתקן המיקרו-נוזלי על גבי משטח ה- MEA, ויישר בזהירות את הרשת המיקרו-מיקרואקטיבית של ה- MEA. שאפו את המים המוגזמים, והם דגירה לילה ב 37 מעלות, כדי לאפשר התקשרות מלאה.
למחרת, לטעון את הבארים עם למינין, ותצנרר שוב. לאחר איסוף העובר susseds, להמשיך לנתח קליפת המוח הקדם חזיתית. התחל על ידי חשיפה זהירה של המוח, באמצעות זוג מדפים.
לאחר מכן, הסר בעדינות את המוח מהחלל שלו. כסו אותו עם H-HBSS קר. כאשר קיים, להסיר ולהשליך את נורות הריח.
לבסוף, לנתח את קליפת המוח הקדם חזיתית. להבטיח הסרה מלאה של קרום ההתהוות. חזור על הליך זה עבור שתי ההמיספרות.
עבור מספר המוחות הדרושים למחקר שלך. בתוך מכסה המנוע לזרימה למינארית, לאסוף את שברי קליפת המוח נותקו בעבר בסך הכל חמישה מיליליטר של H-HBSS. לאחר מכן, להעביר שברים אלה לצינור כרוני סטרילי 15 מיליליטר.
פיפטה, ויש לי 2.3 מיליליטר של פתרון טרי לצינור המכיל את שברי קליפת המוח. מערבבים את ההשעיה, ודגירה ב 37 מעלות במשך 15 דקות. להתסיס כל חמש דקות.
לאחר מכן, השלך את העל-טבעי המכיל את טריפסין, הוסף H-HBSS המכיל FBS, כדי להשבית את טריפסין הנותרים. להתסיס בעדינות. תן שברי קליפת המוח להתיישב, ולהשליך את העל-טבעי.
לשטוף פעמיים עם H-HBSS, כדי להסיר את FBS, ולהשליך את supernatant שוב. מוסיפים מדיום בסיס עצבי נוסף, ומנתקים רקמות מכנית על ידי צינורות לאט למעלה ולמטה. השלך את הרקמה הנותרת על ידי סינון השעיית המלח באמצעות מסננת תאים.
לאחר מכן, לערבב 20 microliters של השעיית תא עם 20 microliters של כחול טריפאן. להעביר 10 microliters לתא Neubauer, ולספור את מספר תאים קיימא. מיד לפני התא יושב, להסיר למינין מכל הבארים של מיקרו EF. לאחר מכן, מוסיפים את הנפח הקטן של מדיום על-טבעי לכל באר של תא האקסונאלי.
לאט לאט זרע חמישה microliters של השעיית תא לתא somal. דגירה ב 37 מעלות במשך שעה אחת כדי לאפשר חיבור תא למצע. לאחר שעה, ממלאים בעדינות כל באר במדיום מתווסף חם.
הוסף אמצעי אחסון קטנים כדי למנוע ניתוק תאים. לאחר מכן, להעביר את מיקרו EF לאנקובטור. כאן מוצגת תרבות בחמישה ימים במבחנה.
אחרי שבוע, תרבויות מתחילות להפגין פעילות ספונטנית. לפני ביצוע הקלטות, השתמש בבקר טמפרטורה כדי לאכול את צלחת בסיס האש מראש. לאחר מכן, מניחים את המיקרו EF על הקדם-דגימה, סוגרים ותופסים את המכסה.
כדי להקליט, פתח את התוכנה הניסיונית מרובת הערוצים. הגדר את קצב הדגימה ל- 20 קילוהרץ. גרור את המסנן ואת התיבות המוקלטות וחבר אותם ברצף כדי להקליט נתונים גולמיים ומסוננים.
התחל את רכישת הנתונים כדי להמחיש את האותות ואת הרשומה המהירה. ניתן לחקור במהירות את הנתונים המוקלטים באמצעות מנתח רב ערוצי. כאן, התפשטות האותות לאורך המיקרוגרובים כבר ברורה.
כדי לזהות ולאפיין אירועים מופצים אלה, פתח את ההקלטה שלך בצייד מיקרו ספייק. לחץ על לחצן פרטי הקובץ כדי לגשת להגדרות ההקלטה ובחר את קבוצת המיקרו אלקטרודות לניתוח. הגדר את הסף להפצת זיהוי אירועים.
ונתונים לקריאה מהירה. התוכנה ת לפרט את כל הרצפים שזוהו. לאחר מכן המשתמש יכול להעריך את מהירות ההפצה כמידע, בין זוגות של אלקטרודות מיקרו, ובהתבסס על המרחק הבין-מרחק והמתאם הצולב שלהם.
הכלי גרף כימותרפיה מאפשר למשתמש להעריך ידנית את מהירות ההפצה. כאן מוצג אירוע הפצה. זוהה לאורך ארבע אלקטרודות מיקרו בתוך מיקרוגרוב.
אירועים אלה יכולים להיות מיוצגים בעלילה של ראסר. הנה פעילות ההפצה לאורך 11 מיקרוגרובים בשתי הדקות הראשונות של ההקלטה. המיקרוגרוב הגבוה והנמוך צבוע בצהוב ואדום, בכבוד.
שימו לב לסנכרון הפעילות לאורך 11 המיקרוגרובים. הסינכרון אינו תלוי בקצב הפעילות. כפי שניתן לראות בווריאציות של קצב הירי המיידי של שני המיקרוגרובים.
מיקרוגרובים מתפקדים גם כמגברי אותות אקסונאליים, כפי שמוצג בעלילה של הקופסה ושפם. הראינו לך כיצד לשלב מיקרו נוזלים עם MEAs, וכיצד לתרבת נוירונים עליהם. כמו כן, כיצד להקליט ולחלץ נתונים משמעותיים מהקלטות אלה.
אנו מקווים הדגמה זו כדי להיות שימושי עבור המחקר שלך, למה ייתכן שתרצה ללמוד את התקשורת במעגלים עצביים.
