O objetivo geral deste protocolo é demonstrar como combinar o uso de micro fluidez com microeletos para gerar a plataforma adequada para o estudo da comunicação neuronal e propagação de sinais axonacionais. Olá, sou Paulo Aguiar e sou o PI do Laboratório de Neurociências em Neuroengenharia e Computação do INEB, usado para codificação para engenharia biomédica na Universidade do Porto, Portugal. Entender a transmissão de informações em circuitos neurológicos continua sendo um dos maiores desafios da neurociência.
Hoje, vou mostrar como podemos combinar matrizes individuais de micro atuadores com micro fluidez e ferramentas de software desenvolvidas aqui em nosso laboratório, para detectar e caracterizar potenciais de ação propagadores. Usamos essa configuração em uma variedade de estudos, ou seja, codificação neural e decodificação, e em comunicações entre neurônios sensoriais e outros tipos de células. Acreditamos que a demonstração visual deste protocolo é crucial.
Uma vez que a montagem de matrizes micro fluidas e micro eletrodos é essa dificuldade de gerenciamento, e difícil de reproduzir apenas reproduzindo protocolos. Para o mercado, as vendas cultas nesta plataforma não são simples, como os ABAs convencionais, e requer atenção especial para as células sentadas e ímãs de cultura. Essa configuração nos permite estudar várias propriedades relacionadas à comunicação, como velocidade e direção de propagação, em um ambiente bem controlado.
Embora o procedimento de gravação seja simples, a análise dos dados requer conhecimento e o uso das ferramentas computacionais certas. No dia anterior à sessão celular, comece preparando os dispositivos micro fluidos, limpando com fita de vinil. Pressione suavemente a fita contra o dispositivo para alcançar todas as áreas do micro fluido.
O plasma de ar limpa o MEA por três minutos para limpar a superfície e torná-la mais hidrofílica. Dentro de uma capa de fluxo laminar, submergir os micro fluidos em 70% de etanol. Deixe-os secar.
Coloque cada MEA em uma placa de petri e esterilize por 15 minutos de exposição à luz UV. Em seguida, vá para a área central do MEA com 500 microliters de solução PEI. Incubar por pelo menos uma hora.
Dentro de uma capa de fluxo laminar, aspire a solução de revestimento PEI da superfície MEA. Em seguida, lave os MEAs quatro vezes com um mililitro de água estéril. Com a ajuda de um microscópio estéril, colocado dentro da capa de fluxo laminar.
Centralizar o chip MEA e adicionar um mililitro de água estéril à área central do MEA. Em seguida, coloque o dispositivo micro fluido no topo da superfície MEA e alinhe cuidadosamente a rede microativa microgrooves do MEA. Aspire a água excessiva e incuba durante a noite a 37 graus, para permitir a fixação completa.
No dia seguinte, carregue os poços com laminina, e incuba novamente. Após a coleta dos susseds embrião, prossiga para a dissecção do córtex pré-frontal. Comece expondo cuidadosamente o cérebro, usando um par de fórceps.
Então, remova suavemente o cérebro da cavidade. Cubra com H-HBSS frio. Quando presente, remova e descarte as lâmpadas olfativas.
Finalmente, dissecar o córtex pré-frontal. Certifique-se da remoção completa das meninges. Repita este procedimento para ambos os hemisférios.
Para o número de cérebros necessários para o seu estudo. Dentro de uma capa de fluxo laminar, colete os fragmentos do córtex anteriormente dissecados em um total de cinco mililitros de H-HBSS. Em seguida, transfira esses fragmentos para um tubo crônico estéril de 15 mililitros.
Pipeta, e tem 2,3 mililitros de solução de trippsina recém-preparada para o tubo contendo os fragmentos do córtex. Misture a suspensão e incubar a 37 graus por 15 minutos. Agitar a cada cinco minutos.
Em seguida, descarte o supernatante contendo a trippsina, adicione H-HBSS contendo FBS, para inativar o restante da trippsina. Gentilmente agitar. Deixe os fragmentos do córtex se acalmarem, e descarte o supernatante.
Lave duas vezes com H-HBSS, para remover o FBS, e descarte o supernatante novamente. Adicione tecidos basais neurais suplementados e mecanicamente dissociados, pipetando lentamente para cima e para baixo. Descarte o tecido restante filtrando a suspensão do sal através de um coador celular.
Em seguida, misture 20 microliters de suspensão celular com 20 microliters de azul tripano. Transfira 10 microliters para uma câmara de Neubauer, e conte o número de células viáveis. Imediatamente antes da cela sentar, remova a laminina de todos os poços do micro EF. Em seguida, adicione o pequeno volume de meio supernante a cada poço do compartimento axonal.
Lentamente semeou cinco microliters de suspensão celular para o compartimento somal. Incubar a 37 graus durante uma hora para permitir a fixação celular ao substrato. Depois de uma hora, encha suavemente cada poço com meio complementado quente.
Adicione pequenos volumes para evitar o desprendimento celular. Em seguida, transfira o micro EF para uma incubadora. Aqui é mostrado uma cultura em cinco dias in vitro.
Após uma semana, as culturas começam a exibir atividade espontânea. Antes de realizar gravações, use um controlador de temperatura para comer a placa base de fogo pré-amp. Em seguida, coloque o micro EF no pré-amplificador e feche e trave a tampa.
Para gravar, abra o software experimental multicanal. Defina a taxa de amostragem para 20 kilohertz. Arraste o filtro e as caixas gravadas e conecte-as sequencialmente para registrar dados crus e filtrados.
Inicie a aquisição de dados para visualizar os sinais e registrar rapidamente. Os dados gravados podem ser rapidamente explorados usando o analisador multicanal. Aqui, a propagação do sinal ao longo dos microgrooves já está clara.
Para identificar e caracterizar esses eventos de propagação, abra sua gravação no micro spike hunter. Clique no botão de informações do arquivo para acessar as configurações de gravação e selecione o conjunto de micro eletrodos para análise. Defina o limiar para propagar a detecção de eventos.
E ler rapidamente os dados. O software listará todas as sequências detectadas. O usuário pode então avaliar a velocidade de propagação como a informação, entre pares de micro eletrodos, e com base em sua inter distância e correlação cruzada.
A ferramenta de quimiografo permite que o usuário estime manualmente a velocidade de propagação. Aqui é mostrado um evento de propagação. Detectado ao longo de quatro micro eletrodos dentro de um microgroove.
Esses eventos podem ser representados em uma trama de Rasser. Aqui está a atividade de propagação ao longo de 11 microgrooves para os primeiros dois minutos de gravação. O microgroove alto e de baixa atividade são coloridos em amarelo e vermelho, respeitosamente.
Observe a sincronização da atividade ao longo dos 11 microgrooves. A sincronização é independente da taxa de atividade. Como pode ser visto nas variações da taxa de disparo instantânea dos dois microgrooves.
Microgrooves também funcionam como amplificadores de sinal axonal, como mostrado na caixa e na trama dos bigodes. Nós mostramos como combinar micro fluidíficas com MEAs, e como cultivar neurônios neles. Além disso, como gravar e extrair dados significativos dessas gravações.
Esperamos que essa demonstração seja útil para sua pesquisa, por que você pode querer estudar a comunicação em circuitos neurais.
