El objetivo general de este protocolo es demostrar cómo combinar el uso de micro fluidos con matrices de micro electrodes para generar la plataforma adecuada para el estudio de la comunicación neuronal y la propagación de la señal axonal. Hola, soy Paulo Aguiar y soy el PI del Laboratorio de Neuro ingeniería y Neurociencia Computacional del INEB, acostumbrado a codificar para ingeniería biomédica en la Universidad de Oporto, Portugal. Comprender la transmisión de información en los circuitos neurológicos sigue siendo uno de los mayores desafíos en neurociencia.
Hoy, voy a mostrarles cómo podemos combinar matrices de microaccionados individuales con micro fluidos y herramientas de software desarrolladas aquí en nuestro laboratorio, para detectar y caracterizar potenciales de acción de propagación. Utilizamos esta configuración en una variedad de estudios, a saber, la codificación neuronal y la decodificación, y en las comunicaciones entre las neuronas sensoriales y otros tipos de células. Creemos que la demostración visual de este protocolo es crucial.
Dado que el conjunto de matrices de micro fluidos y micro electrodes es esa dificultad en la gestión, y difícil de reproducir con solo reproducir protocolos. Para el mercado, las ventas de culto en esta plataforma no son sencillas, como las AFA convencionales, y requiere una atención especial a las celdas sentadas, e imanes de cultivo. Esta configuración nos permite estudiar varias propiedades relacionadas con la comunicación, como la velocidad de propagación y la dirección, en un entorno bien controlado.
Aunque el procedimiento de grabación es simple, el análisis de datos requiere conocimiento y el uso de las herramientas computacionales adecuadas. El día antes de la sesión de la célula, comience preparando los dispositivos micro fluidos, limpiando con cinta adhesiva. Presione suavemente la cinta contra el dispositivo para llegar a todas las áreas del micro fluido.
El plasma de aire limpia el MEA durante tres minutos para limpiar la superficie y hacerla más hidrófila. Dentro de una campana de flujo laminar, sumerja los micro fluidos en un 70 por ciento de etanol. Deje que se sequen al aire.
Coloque cada MEA en un plato de petri y esterilice 15 minutos de exposición a la luz UV. A continuación, vaya a la zona central de MEA con 500 microlitros de solución PEI. Incubar durante al menos una hora.
Dentro de una campana de flujo laminar, aspirar la solución de recubrimiento PEI de la superficie MEA. A continuación, lave los MEA cuatro veces con un mililitro de agua estéril. Con la ayuda de un microscopio estéril, colocado dentro de la campana de flujo laminar.
Centrar el chip MEA, y añadir un mililitro de agua estéril a la zona central del MEA. A continuación, coloque el dispositivo micro fluido en la parte superior de la superficie MEA y alinee cuidadosamente la microgrooves micro cuadrícula activa del MEA. Aspirar el exceso de agua, e incubar durante la noche a 37 grados, para permitir un apego completo.
Al día siguiente, cargue los pozos con laminin e incubar de nuevo. Después de recoger los susseds embrionarios, proceder a la disección de corteza prefrontal. Comienza exponiendo cuidadosamente el cerebro, usando un par de fórceps.
Luego, retira suavemente el cerebro de su cavidad. Cúbralo con H-HBSS frío. Cuando esté presente, retire y deseche las bombillas olfativas.
Finalmente, disecciona la corteza prefrontal. Asegurar la eliminación completa de los meninges. Repita este procedimiento para ambos hemisferios.
Para el número de cerebros necesarios para su estudio. Dentro de una campana de flujo laminar, recoger los fragmentos de corteza previamente diseccionados en un total de cinco mililitros de H-HBSS. Luego, transfiera estos fragmentos a un tubo crónico estéril de 15 mililitros.
Pipetear y tener 2,3 mililitros de solución de trippsina recién preparada en el tubo que contiene los fragmentos de corteza. Mezclar la suspensión e incubar a 37 grados durante 15 minutos. Agitar cada cinco minutos.
A continuación, deseche el sobrenadante que contiene la tripina, agregue H-HBSS que contenga FBS, para desactivar la tripina restante. Agitar suavemente. Deja que los fragmentos de la corteza se asienten y deseche el sobrenadante.
Lavar dos veces con H-HBSS, para quitar el FBS, y desechar el sobrenadante de nuevo. Añadir medio basal neural suplementado, y disociar mecánicamente los tejidos por pipetear lentamente arriba y abajo. Deseche el tejido restante filtrando la suspensión de sal a través de un colador celular.
A continuación, mezclar 20 microlitros de suspensión celular con 20 microlitros de color azul tripano. Transfiera 10 microlitros a una cámara Neubauer y cuente el número de células viables. Inmediatamente antes de estar sentado en la celda, retire la laminin de todos los pozos del micro EF. A continuación, añada el pequeño volumen de medio sobrenadante a cada pozo del compartimiento axonal.
Sembra lentamente cinco microlitros de suspensión celular al compartimento somal. Incubar a 37 grados durante una hora para permitir la fijación celular al sustrato. Después de una hora, llene suavemente cada pozo con un medio caliente suplementado.
Agregue volúmenes pequeños para evitar el desprendimiento de celdas. A continuación, transfiera el micro EF a una incubadora. Aquí se muestra una cultura a los cinco días in vitro.
Después de una semana, los cultivos comienzan a exhibir actividad espontánea. Antes de realizar grabaciones, utilice un controlador de temperatura para comer la placa base de fuego del prea amplificado. A continuación, coloque el micro EF en el preamplificador y cierre y cierre la tapa.
Para grabar, abra el software experimental multicanal. Establezca la frecuencia de muestreo en 20 kilohercios. Arrastre los cuadros de filtro y grabados y conéctelos secuencialmente para registrar datos sin procesar y filtrados.
Inicie la adquisición de datos para visualizar las señales y el registro rápido. Los datos grabados se pueden explorar rápidamente mediante el analizador multicanal. Aquí, la propagación de la señal a lo largo de los microgrooves ya está clara.
Para identificar y caracterizar estos eventos de propagación, abra la grabación en el micro cazador de picos. Haga clic en el botón de información del archivo para acceder a la configuración de grabación y seleccione el conjunto de microdóditos para el análisis. Establezca el umbral para propagar la detección de eventos.
Y leer los datos rápidos. El software enumerará todas las secuencias detectadas. A continuación, el usuario puede evaluar la velocidad de propagación como la información, entre pares de micro electrodos, y en función de su entre distancia y correlación cruzada.
La herramienta de gráficos químicos permite al usuario estimar manualmente la velocidad de propagación. Aquí se muestra un evento de propagación. Detectado a lo largo de cuatro micro electrodos dentro de un microgroove.
Estos eventos se pueden representar en una gráfica de Rasser. Aquí está la actividad de propagación a lo largo de 11 microgrooves durante los primeros dos minutos de grabación. El microgroove alto y bajo de actividad son de color amarillo y rojo, respetuosamente.
Observe la sincronización de la actividad a lo largo de los 11 microgrooves. La sincronización es independiente de la velocidad de actividad. Como se puede ver en las variaciones de la velocidad de disparo instantánea de las dos microgrooves.
Las microgrooves también funcionan como amplificadores de señal axonal, como se muestra en la caja y la gráfica de bigotes. Le hemos mostrado cómo combinar micro fluidos con LOS MEA, y cómo cultivar neuronas en ellos. Además, cómo grabar y extraer datos significativos de esas grabaciones.
Esperamos que esta demostración sea útil para su investigación, por qué puede querer estudiar la comunicación en circuitos neuronales.
