このプロトコルの全体的な目標は、マイクロ流体とマイクロ電極アレイを組み合わせて、神経伝達と軸索信号伝播の研究に適したプラットフォームを生成する方法を実証することです。こんにちは、私はパウロ・アギアールで、私はポルトガルのポルト大学で生物医学工学のコードを書くために使用されるINEBの神経工学と計算神経科学ラボのPIです。神経回路における情報伝達を理解することは、神経科学における最大の課題の1つです。
今日は、個々のマイクロアクチュエータアレイと、当社のラボで開発されたマイクロ流体およびソフトウェアツールを組み合わせて、伝達するアクション電位を検出して特徴付ける方法を紹介します。この設定は、さまざまな研究、すなわち神経コーディングとデコード、および感覚ニューロンと他の細胞タイプ間の通信で使用します。このプロトコルの視覚的なデモンストレーションは非常に重要であると考えています。
マイクロ流体およびマイクロ電極アレイアセンブリは管理が困難であるため、プロトコルを再現するだけで再現が困難です。市場にとって、このプラットフォームでのカルト販売は、従来のAABのように簡単ではなく、セルシッティングのもの、および培養磁石に特別な注意が必要です。この設定により、伝播速度や方向など、よく制御された環境での通信関連の特性を調べることができます。
記録手順は単純ですが、データ分析には知識と適切な計算ツールの使用が必要です。セルが座る前日に、マイクロ流体デバイスを準備し、ビニールテープでクリーニングすることによって開始します。テープをデバイスにそっと押し付けて、マイクロ流体のすべての領域に到達します。
空気プラズマは、表面をきれいにし、より親水性にするために3分間MEAをきれいにします。層流フードの内部で、マイクロ流体を70%エタノールに沈める。彼らが空気乾燥することを許可します。
各MEAをシャーレに入れ、15分間の紫外線暴露で殺菌する。その後、500マイクロリットルのPEI溶液でMEAの中央領域に行きます。少なくとも1時間インキュベートする。
層流フードの内側に、MEA表面からPEIコーティング溶液を吸引する。その後、滅菌水1ミリリットルでMEAを4回洗います。滅菌顕微鏡の助けを借りて、層流フードの内部に置かれる。
MEAチップを中央に配置し、1ミリリットルの無菌水をMEAの中央領域に加えます。次に、MEA表面の上にマイクロ流体装置を配置し、MEAのマイクロアクティブグリッドのマイクロ溝を慎重に整列させます。過剰な水を吸引し、37度で一晩インキュベートし、完全な付着を可能にする。
翌日、ラミニンで井戸を積み込み、再びインキュベートします。胚のサスを採取した後、前頭前野解剖に進む。鉗子のペアを使用して、慎重に脳を露出させることから始めます。
その後、空洞から脳をそっと取り除きます。冷たいH-HBSSでそれをカバーしてください。存在する場合は、嗅球を取り外して捨てます。
最後に、前頭前野を解剖する。髄液の完全な除去を確認します。両方の半球に対してこの手順を繰り返します。
あなたの研究に必要な脳の数のために。層流フードの内部で、以前にH-HBSSの合計5ミリリットルで解剖された皮質断片を収集する。次いで、これらの断片を滅菌15ミリリットルの慢性チューブに移す。
ピペット、皮質断片を含むチューブに調製したばかりのトリプシン溶液を2.3ミリリットル有する。懸濁液を混合し、37度で15分間インキュベートします。5分ごとに攪拌します。
次に、トリプシンを含む上清を捨て、FBSを含むH-HBSSを添加し、残りのトリプシンを不活性化する。穏やかに攪拌します。皮質の断片を落ち着かせ、上清を捨てます。
H-HBSSで2回洗浄し、FBSを取り除き、上澄み物を再度捨てます。補足された神経基底培地を追加し、ゆっくりと上下にピペットを行うことによって組織を機械的に解化する。細胞ストレーナーを通して塩懸濁液を濾過することによって残りの組織を捨てる。
次に、20マイクロリットルのセル懸濁液を20マイクロリットルのトリパンブルーと混合します。10マイクロリットルをノイバウアーチャンバーに移し、生存細胞の数を数える。細胞が座る直前に、マイクロEFのすべての井戸からラミニンを取り除きます。次に、軸索コンパートメントの各ウェルに上清培地の小容量を加えます。
5マイクロリットルの細胞懸濁液を体液室にゆっくりと播種する。細胞が基板に付着できるように、37度で1時間インキュベートします。1時間後、温かい補充された媒体で各井戸をそっと満たします。
セルの分離を避けるために、少量を追加します。次いで、マイクロEFをインキュベーターに移します。ここでは、インビトロで5日間の培養を示す。
1週間後、文化は自発的な活動を示し始めます。録音を行う前に、温度コントローラを使用してプリアンプ火災ベースプレートを食べます。次に、マイクロEFをプリアンプに置き、蓋を閉じてラッチします。
記録するには、マルチチャンネル実験ソフトウェアを開きます。サンプリング レートを 20 キロヘルツに設定します。フィルタと記録されたボックスをドラッグし、それらを連続して接続して、生データとフィルタリングされたデータの両方を記録します。
信号を視覚化し、迅速な記録を取得するデータ収集を開始します。記録されたデータは、マルチチャンネルアナライザを使用して迅速に探索することができます。ここで、マイクロ溝に沿った信号伝搬は既に明らかになっている。
この伝播イベントを識別して特徴付けるには、マイクロスパイクハンターで録音を開きます。ファイル情報ボタンをクリックして記録設定にアクセスし、分析用のマイクロ電極のセットを選択します。イベントの伝達のしきい値を設定します。
そして、データを素早く読み取ります。ソフトウェアは、検出されたすべてのシーケンスを一覧表示します。その後、伝播速度を情報として、マイクロ電極の対の間、およびそれらの距離間相関と相互相関に基づいて評価することができます。
この化学グラフツールを使用すると、伝播速度を手動で推定できます。ここでは、伝播イベントを示しています。マイクロ溝内の4つのマイクロ電極に沿って検出される。
これらのイベントは、ラッサープロットで表すことができます。ここでは、記録の最初の2分間の11マイクログルーブに沿った伝達活動です。高く、低い活動のマイクロ溝は、丁重に黄色と赤で着色されています。
11 マイクログルーブに沿ったアクティビティの同期化に注意してください。同期は、アクティビティの速度とは関係ありません。2つのマイクロ溝の瞬間焼成速度の変動に見られるように。
マイクログルーブは、箱とウィスカプロットに示すように、軸索信号増幅器としても機能します。マイクロ流体とMEAを組み合わせる方法と、ニューロンを培養する方法を示しました。また、これらの記録から意味のあるデータを記録し、抽出する方法。
このデモンストレーションが、なぜ神経回路のコミュニケーションを研究したいのか、研究に役立つことを願っています。
