Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie der Einsatz von Mikrofluidik mit Mikroelektroden-Arrays kombiniert werden kann, um die Plattform zu generieren, die für die Untersuchung der neuronalen Kommunikation und axonalen Signalausbreitung geeignet ist. Hallo, ich bin Paulo Aguiar und ich bin der PI des Neuro Engineering and Computation Neuroscience Lab am INEB, das für biomedizinische Technik an der Universität Porto, Portugal, verwendet wird. Das Verständnis der Informationsübertragung in Neuroschaltungen bleibt eine der größten Herausforderungen in der Neurowissenschaft.
Heute werde ich Ihnen zeigen, wie wir einzelne Mikroaktuator-Arrays mit Mikrofluidik und Software-Tools kombinieren können, die hier in unserem Labor entwickelt wurden, um sich ausbreitende Aktionspotenziale zu erkennen und zu charakterisieren. Wir verwenden dieses Setup in einer Vielzahl von Studien, nämlich neuronale Codierung und Dekodierung, und in der Kommunikation zwischen sensorischen Neuronen und anderen Zelltypen. Wir glauben, dass die visuelle Demonstration dieses Protokolls von entscheidender Bedeutung ist.
Da Mikrofluid- und Mikroelektroden-Arrays-Montage ist diese Schwierigkeit bei der Verwaltung, und schwierig zu reproduzieren, nur durch die Reproduktion von Protokollen. Für den Markt ist der Kultverkauf auf dieser Plattform nicht einfach, wie die herkömmlichen ABAs, und es erfordert besondere Aufmerksamkeit auf das Zellsitzen und Kulturmagnete. Dieses Setup ermöglicht es uns, mehrere kommunikationsbezogene Eigenschaften, wie Ausbreitungsgeschwindigkeit und -richtung, in einer gut kontrollierten Umgebung zu untersuchen.
Obwohl das Aufzeichnungsverfahren einfach ist, erfordert die Datenanalyse Wissen und den Einsatz der richtigen Rechenwerkzeuge. Am Tag vor dem Zellensitzen beginnen Sie mit der Vorbereitung der mikrofluidischen Geräte, indem Sie mit Vinylband reinigen. Drücken Sie das Band vorsichtig gegen das Gerät, um alle Bereiche des Mikrofluids zu erreichen.
Luftplasma reinigen das MEA für drei Minuten, um die Oberfläche zu reinigen und hydrophiler zu machen. In einer laminaren Strömungshaube tauchen Sie die Mikrofluidik in 70 Prozent Ethanol ein. Lassen Sie sie trocknen.
Legen Sie jedes MEA in eine Petrischale und sterilisieren Sie sie mit 15 Minuten UV-Lichteinwirkung. Gehen Sie dann in den zentralen Bereich von MEA mit 500 MikroliterPEI-Lösung. Mindestens eine Stunde inkubieren.
In einer laminaren Strömungshaube die PEI-Beschichtungslösung von der MEA-Oberfläche aus ansaugen. Dann waschen Sie die MEAs viermal mit einem Milliliter sterilem Wasser. Mit Hilfe eines sterilen Mikroskops, das in der laminaren Strömungshaube platziert wird.
Zentrieren Sie den MEA-Chip, und fügen Sie einen Milliliter sterilen Wassers in den zentralen Bereich des MEA ein. Als Nächstes legen Sie das mikrofluidische Gerät auf die MEA-Oberfläche und richten Sie das mikrogrooves Mikroaktive Gitter des MEA sorgfältig aus. Das übermäßige Wasser ansaugen und über Nacht bei 37 Grad bebrüten, um eine vollständige Befestigung zu ermöglichen.
Am nächsten Tag die Brunnen mit Laminin beladen und wieder bebrüten. Nach dem Sammeln des Embryos susseds, gehen Sie zur präfrontalen Kortex-Sektion. Beginnen Sie mit der sorgfältigen Exposition des Gehirns, mit einem Paar Zange.
Dann, entfernen Sie vorsichtig das Gehirn aus seiner Höhle. Bedecken Sie es mit kaltem H-HBSS. Entfernen und entsorgen Sie die Olfaktor-Lampen, wenn vorhanden, und entsorgen Sie sie.
Schließlich sezieren Sie den präfrontalen Kortex. Stellen Sie sicher, dass die Meningen vollständig entfernt werden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für beide Hemisphären.
Für die Anzahl der Gehirne, die für Ihre Studie benötigt werden. In einer laminaren Strömungshaube sammeln Sie die zuvor sezierten Kortexfragmente in insgesamt fünf Milliliterh H-HBSS. Dann übertragen Sie diese Fragmente in eine sterile 15 Milliliter chronische Röhre.
Pipette und haben 2,3 Milliliter frisch zubereitete Trypsin-Lösung in die Röhre mit den Kortexfragmenten. Mischen Sie die Suspension, und inkubieren bei 37 Grad für 15 Minuten. Alle fünf Minuten aufräumen.
Entsorgen Sie dann den Überstand, der das Trypsin enthält, fügen Sie H-HBSS mit FBS hinzu, um das verbleibende Trypsin zu deaktivieren. Sanft rühren. Lassen Sie die Kortexfragmente sich absetzen und verwerfen Sie den Überstand.
Waschen Sie zweimal mit H-HBSS, um den FBS zu entfernen, und entsorgen Sie den Überstand erneut. Fügen Sie ergänzte neuronale Basalmedium, und mechanisch dissoziieren Gewebe durch langsampipettieren nach oben und unten. Entsorgen Sie das restliche Gewebe, indem Sie die Salzsuspension durch ein Zellsieb filtern.
Dann mischen Sie 20 Mikroliter Zellsuspension mit 20 Mikroliter Trypan blau. Übertragen Sie 10 Mikroliter in eine Neubauer-Kammer und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen. Unmittelbar vor dem Sitzen der Zelle Laminin aus allen Brunnen des Mikro-EF entfernen. Fügen Sie dann das kleine Volumen des überstandenen Mediums zu jedem Brunnen des axonalen Fachs hinzu.
Langsam säen Sie fünf Mikroliter Zellsuspension in das somal Fach. Inkubieren Sie bei 37 Grad für eine Stunde, um eine Zellanhaftung am Substrat zu ermöglichen. Nach einer Stunde jeden Brunnen vorsichtig mit warmem, ergänztem Medium füllen.
Fügen Sie kleine Volumes hinzu, um eine Zellablösung zu vermeiden. Übertragen Sie dann den Micro EF in einen Inkubator. Hier wird eine Kultur an fünf Tagen in vitro gezeigt.
Nach einer Woche beginnen die Kulturen spontane Aktivitäten zu zeigen. Verwenden Sie vor der Durchführung von Aufzeichnungen einen Temperaturregler, um die Vorverstärker-Feuergrundplatte zu essen. Legen Sie dann das Mikro EF auf den Vorverstärker, und schließen und verriegeln Sie den Deckel.
Um aufzuzeichnen, öffnen Sie die Mehrkanal-Experimentalsoftware. Stellen Sie die Abtastrate auf 20 Kilohertz ein. Ziehen Sie den Filter und die aufgezeichneten Felder, und verbinden Sie sie sequenziell, um sowohl unformatierte als auch gefilterte Daten aufzuzeichnen.
Starten Sie die Datenerfassung, um die Signale zu visualisieren, und können Sie schnell aufzeichnen. Die aufgezeichneten Daten können schnell mit Multi-Channel-Analysator untersucht werden. Hier ist die Signalausbreitung entlang der Microgrooves bereits klar.
Um diese sich ausbreitenden Ereignisse zu identifizieren und zu charakterisieren, öffnen Sie Ihre Aufnahme im Mikro-Spike-Jäger. Klicken Sie auf die Schaltfläche Dateiinformationen, um auf die Aufnahmeeinstellungen zuzugreifen, und wählen Sie den Satz von Mikroelektroden für die Analyse aus. Legen Sie den Schwellenwert für die Weitergabe der Ereigniserkennung fest.
Und schnell es lesen. Die Software listet alle erkannten Sequenzen auf. Der Benutzer kann dann die Ausbreitungsgeschwindigkeit als Information, zwischen Paaren von Mikroelektroden und basierend auf ihrer Interentfernung und Kreuzkorrelation bewerten.
Mit dem Chemo-Graph-Tool kann der Benutzer die Ausbreitungsgeschwindigkeit manuell abschätzen. Hier wird ein Propagierendes Ereignis gezeigt. Wird entlang von vier Mikroelektroden innerhalb einer Mikronut detektiert.
Diese Ereignisse können in einem Rasser-Plot dargestellt werden. Hier ist die Verbreitungsaktivität entlang 11 Microgrooves für die ersten zwei Minuten der Aufnahme. Die hohe und die geringe Aktivität Microgroove sind in gelb und rot gefärbt, respektvoll.
Beachten Sie die Synchronisierung der Aktivität entlang der 11 Microgrooves. Die Synchronisierung ist unabhängig von der Aktivitätsrate. Wie sich in den Variationen der momentanen Abschussrate der beiden Mikrogrooves zeigt.
Microgrooves fungieren auch als axonale Signalverstärker, wie in der Box und Whiskers-Plot gezeigt. Wir haben Ihnen gezeigt, wie man Mikrofluidik mit MEAs kombiniert und wie man Neuronen darauf kultiviert. Außerdem, wie man aussagekräftige Daten aus diesen Aufzeichnungen aufzeichnet und extrahiert.
Wir hoffen, dass diese Demonstration für Ihre Forschung nützlich ist, warum Sie vielleicht die Kommunikation in neuronalen Schaltkreisen studieren möchten.
