الهدف العام لهذا البروتوكول هو شرح كيفية الجمع بين استخدام السوائل الدقيقة مع صفائف القطب الصغير لتوليد منصة مناسبة لدراسة الاتصالات العصبية وانتشار إشارة محور عصبي. مرحبا، أنا باولو أغيلار وأنا PI من الهندسة العصبية وحساب مختبر علم الأعصاب في INEB، وتستخدم لرمز للهندسة الطبية الحيوية في جامعة بورتو، البرتغال. لا يزال فهم نقل المعلومات في الدوائر العصبية أحد أكبر التحديات في علم الأعصاب.
اليوم، سأريك كيف يمكننا الجمع بين صفائف المحركات الدقيقة الفردية مع السوائل الدقيقة وأدوات البرمجيات التي تم تطويرها هنا في مختبرنا، للكشف عن خصائص إمكانيات نشر العمل. نستخدم هذا الإعداد في مجموعة متنوعة من الدراسات، وهي الترميز العصبي وفك التشفير، وفي الاتصالات بين الخلايا العصبية الحسية وأنواع الخلايا الأخرى. ونعتقد أن البيان المرئي لهذا البروتوكول أمر بالغ الأهمية.
منذ ميكرو fluidic و microي الأقطاب صفائف التجميع هو أن صعوبة في إدارة، ويصعب استنساخ فقط عن طريق استنساخ البروتوكولات. بالنسبة للسوق ، مبيعات الطوائف على هذه المنصة ليست مباشرة ، مثل ABAs التقليدية ، وتتطلب اهتمامًا خاصًا بالاشياء الجالسة في الخلية ، ومغناطيس الثقافة. هذا الإعداد يسمح لنا لدراسة العديد من خصائص الاتصالات ذات الصلة، مثل سرعة الانتشار والاتجاه، في بيئة تسيطر عليها بشكل جيد.
على الرغم من أن إجراءات التسجيل بسيطة، يتطلب تحليل البيانات المعرفة واستخدام الأدوات الحسابية الصحيحة. في اليوم السابق للجلوس الخلية، تبدأ من خلال إعداد الأجهزة السائلة الصغيرة، عن طريق تنظيف مع شريط الفينيل. اضغط بلطف على الشريط ضد الجهاز للوصول إلى جميع مناطق السائلة الدقيقة.
بلازما الهواء تنظيف MEA لمدة ثلاث دقائق لتنظيف السطح وجعله أكثر هيدروفيلي. داخل غطاء تدفق الرقائق، غمر السوائل الدقيقة في الإيثانول 70 في المئة. السماح لهم للهواء الجافة.
ضع كل MEA في طبق بتري، وتعقيمه قبل 15 دقيقة من التعرض للضوء فوق البنفسجي. ثم، انتقل إلى المنطقة الوسطى في MEA مع 500 ميكرولترات من حل PEI. احتضان لمدة ساعة واحدة على الأقل.
داخل غطاء تدفق صفح، الطامح حل طلاء PEI من سطح MEA. ثم، غسل الاتفاقات ME أربع مرات مع ملليلتر واحد من الماء المعقم. مع مساعدة من المجهر العقيمة، وضعت داخل غطاء محرك التدفق الفاتن.
مركز رقاقة MEA، وإضافة ملليلتر واحد من الماء المعقم إلى المنطقة الوسطى من MEA. بعد ذلك، ضع الجهاز السائل الصغير على سطح MEA، وقم بمحاذاة الشبكة النشطة الدقيقة للميكروروفوف بعناية. استلهم الماء الزائد، واحتضانه بين عشية وضحاها عند درجة 37، للسماح بتعلق كامل.
في اليوم التالي، قم بتحميل الآبار باللامينين، وحضنها مرة أخرى. بعد جمع الزى الجنين، انتقل إلى تشريح قشرة الفص الجبهي. ابدأ بفضح الدماغ بعناية، باستخدام زوج من ملقط.
ثم، إزالة بلطف الدماغ من تجويف انها. غطّه بـ H-HBSS البارد. عندما تكون موجودة، وإزالة وتجاهل المصابيح الشم.
وأخيراً، تشريح قشرة الفص الجبهي. ضمان الإزالة الكاملة لل السحايات. كرر هذا الإجراء لكلا نصفي الكرة الأرضية.
لعدد العقول المطلوبة لدراستك. داخل غطاء تدفق لارينار، وجمع شظايا القشرة تشريح سابقا في ما مجموعه خمسة ملليلتر من H-HBSS. ثم، نقل هذه الشظايا إلى أنبوب مزمن 15 ملليلتر معقمة.
الماصات، ولها 2.3 ملليلتر من محلول التربسين الطازجة التي تم إعدادها إلى الأنبوب الذي يحتوي على شظايا القشرة. اخلطي التعليق، وحضني في درجة 37 لمدة 15 دقيقة. تهيج كل خمس دقائق.
ثم، تجاهل supernatant التي تحتوي على التربسين، إضافة H-HBSS تحتوي على FBS، لإلغاء تنشيط التربسين المتبقية. يهتاج بلطف. دع شظايا القشرة تستقر، وتخلص من المُتهان.
غسل مرتين مع H-HBSS، لإزالة FBS، والتخلص من افرنح مرة أخرى. إضافة ملحق المتوسطة القاعدية العصبية، وفك ميكانيكيا الأنسجة عن طريق الأنابيب ببطء صعودا وهبوطا. تخلص من الأنسجة المتبقية عن طريق تصفية التعليق الملح من خلال مصفاة الخلية.
ثم، مزيج 20 ميكرولترات من تعليق الخلية مع 20 ميكرولترات من الأزرق trypan. نقل 10 ميكرولترتر إلى غرفة Neubauer، وفرز عدد الخلايا القابلة للحياة. قبل الجلوس في الخلية مباشرة، قم بإزالة اللامينين من جميع آبار micro EF. ثم، إضافة حجم صغير من المتوسط فائقة إلى كل بئر من المقصورة محور عصبي.
بذور ببطء خمسة microliters من تعليق الخلية إلى حجرة سومال. احتضان في 37 درجة لمدة ساعة واحدة للسماح مرفق الخلية إلى الركيزة. بعد ساعة واحدة، ملء بلطف كل بئر مع المتوسطة الدفء الملحقة.
إضافة وحدات تخزين صغيرة لتجنب انفصال الخلايا. ثم، نقل EF الصغرى إلى حاضنة. هنا يظهر ثقافة في خمسة أيام في المختبر.
بعد أسبوع واحد، تبدأ الثقافات في إظهار النشاط العفوي. قبل إجراء التسجيلات، استخدم وحدة تحكم درجة الحرارة لأكل لوحة قاعدة الحريق السابقة أمبير. ثم ضع ef الصغري على preamplifier، وإغلاق وتعلق الغطاء.
للتسجيل، افتح البرنامج التجريبي متعدد القنوات. تعيين معدل أخذ العينات إلى 20 كيلو هرتز. اسحب الفلتر ومربعات المسجلة، وقم بتوصيلها بشكل تسلسلي لتسجيل البيانات الأولية والبيانات التي تمت تصفيتها.
بدء الحصول على البيانات لتصور الإشارات، وسجل سريع. يمكن استكشاف البيانات المسجلة بسرعة باستخدام محلل القنوات المتعددة. هنا ، وانتشار إشارة على طول microgrooves واضح بالفعل.
لتحديد وتوصيف هذه الأحداث نشر، فتح التسجيل الخاص بك في صياد ارتفاع صغير. انقر فوق زر معلومات الملف للوصول إلى إعدادات التسجيل، وحدد مجموعة الأقطاب الكهربائية الصغيرة للتحليل. تعيين عتبة نشر الكشف عن الحدث.
وقراءة سريعة للبيانات. البرنامج سوف قائمة جميع التسلسلات المكتشفة. ويمكن للمستخدم بعد ذلك تقييم سرعة الانتشار على أنها معلومات، بين أزواج من الأقطاب الكهربائية الصغيرة، واستناداً إلى المسافة البينية والارتباط المتبادل.
وتسمح أداة الرسم البياني الكيميائي للمستخدم بتقدير سرعة الانتشار يدوياً. هنا هو عرض حدث نشر. تم اكتشافه على طول أربعة أقطاب كهربائية صغيرة داخل ميكروغرووف.
يمكن تمثيل هذه الأحداث في مؤامرة راسر. هنا هو نشاط نشر على طول 11 microgrooves لأول دقيقتين من التسجيل. يتم تلوين microgroove عالية ومنخفضة النشاط باللونين الأصفر والأحمر ، بكل احترام.
إشعار تزامن النشاط على طول microgrooves 11. التزامن مستقل عن معدل النشاط. كما يمكن أن نرى في الاختلافات من معدل اطلاق النار لحظية من اثنين من microgrooves.
ميكروغرووف تعمل أيضا كمكبرات صوت إشارة محورية، كما هو موضح في المربع وخفقات مؤامرة. لقد أظهرنا لك كيفية الجمع بين السوائل الدقيقة مع اتفاقات الاستثمار الصغيرة ، وكيفية زراعة الخلايا العصبية عليها. أيضا ، كيفية تسجيل واستخراج بيانات ذات مغزى من تلك التسجيلات.
نأمل أن تكون هذه المظاهرة مفيدة لأبحاثك ، لماذا قد ترغب في دراسة الاتصالات في الدوائر العصبية.
