Bu protokolün genel amacı, nöronal iletişim ve aksonal sinyal yayılımı için uygun platformu oluşturmak için mikro akışkanların mikro elektrot dizileri ile nasıl birleştirilebildiğini göstermektir. Merhaba, ben Paulo Aguiar ve ben INEB Nöromühendislik ve Hesaplama Nörobilim Laboratuvarı PI, Porto Üniversitesi biyomedikal mühendisliği için kullanılan, Portekiz. Nöro devrelerde bilgi iletimini anlamak nörobilimdeki en büyük zorluklardan biri olmaya devam etmektedir.
Bugün, size bireysel mikro aktüatör dizilerini laboratuarımızda geliştirilen mikro akışkanlar ve yazılım araçlarıyla nasıl birleştirebileceğimizi göstereceğim. Bu kurulumu, nöral kodlama ve kod çözme gibi çeşitli çalışmalarda ve duyusal nöronlar ve diğer hücre tipleri arasındaki iletişimde kullanırız. Bu protokolün görsel olarak gösterilmesinin çok önemli olduğuna inanıyoruz.
Mikro akışkan ve mikro elektrot dizilerinin montajı bu yönetimde zor olduğundan ve sadece protokolleri üreterek çoğaltılması zor. Pazar için, bu platformda kült satış basit değildir, geleneksel ABAs olarak, ve hücre oturma şeyler özel dikkat gerektirir, ve kültür mıknatıslar. Bu kurulum, iyi kontrol edilen bir ortamda yayılma hızı ve yönü gibi iletişimle ilgili çeşitli özellikleri incelememize olanak tanır.
Kayıt prosedürü basit olmasına rağmen, veri analizi bilgi ve doğru hesaplama araçlarının kullanımını gerektirir. Hücre oturmadan bir gün önce, vinil bant ile aşağı temizleyerek, mikro akışkan cihazlar hazırlayarak başlar. Mikro akışkan tüm alanlara ulaşmak için bandı cihaza doğru hafifçe bastırın.
Hava plazmayüzeyi temizlemek ve daha hidrofilik yapmak için üç dakika MEA temizleyin. Bir laminar akış kaputiçinde, yüzde 70 etanol mikro akışkanlar batırın. Kurumasını bekleyin.
Her MEA'yı bir petri kabına yerleştirin ve 15 dakikalık UV ışığına maruz kalarak sterilize edin. Daha sonra, 500 mikrolitre PEI çözeltisi ile MEA'nın merkezi bölgesine gidin. En az bir saat kuluçkaya yat.
Laminar akış kaputunun içinde, MEA yüzeyinden PEI kaplama çözeltisini aspire edin. Daha sonra, bir mililitre steril su ile MEAs dört kez yıkayın. Steril bir mikroskop yardımıyla, laminar akış kaputu içine yerleştirilir.
MEA çipini ortalayın ve MEA'nın merkezi bölgesine bir mililitre steril su ekleyin. Daha sonra, mikro akışkan cihazı MEA yüzeyinin üzerine yerleştirin ve MEA'nın mikro oluklarını dikkatlice hizalayın. Aşırı su aspire, ve bir gecede kuluçka 37 derece, tam eki izin vermek için.
Ertesi gün, lamina ile kuyuyük ve tekrar kuluçka. Embriyo susseds topladıktan sonra, prefrontal korteks diseksiyonu devam edin. Bir çift forceps kullanarak beyni dikkatlice teşhir ederek başlayın.
Sonra, yavaşça onun boşluğundan beyin çıkarın. Üzerini soğuk H-HBSS ile kapatın. Mevcut olduğunda, çıkarTın ve koku ampulleri atın.
Son olarak, prefrontal korteks iksiyon. Menenjitlerin tamamen çıkarıldığından emin olun. Her iki hemisfer için de bu işlemi tekrarlayın.
Çalışmanız için gereken beyin sayısı için. Bir laminar akış kaputunun içinde, daha önce h-HBSS beş mililitre toplam parçalanmış korteks parçaları toplamak. Sonra, steril bir 15 mililitre kronik tüp bu parçaları aktarın.
Pipet, ve korteks parçaları içeren tüp için taze hazırlanmış tripsin çözeltisi 2.3 mililitre var. Süspansiyonu karıştırın ve 37 derecede 15 dakika kuluçkaya yat. Her beş dakikada bir ajite.
Daha sonra, trypsin içeren supernatant atın, kalan trypsin inactivate için FBS içeren H-HBSS ekleyin. Yavaşça çalkalayın. Korteks parçaları sakinleşsin ve süpernatantı atsın.
FBS'yi çıkarmak için H-HBSS ile iki kez yıkayın ve süpernatant'ı tekrar atın. Takviye nöral bazal orta ekleyin, ve mekanik yavaş yavaş yukarı ve aşağı borulama dokuları ayrıştırMak. Bir hücre süzgeci ile tuz süspansiyon filtreleyerek kalan doku atın.
Daha sonra, 20 mikrolitre hücre süspansiyonu ile 20 mikrolitre trypan mavisini karıştırın. 10 mikrolitreyi Neubauer odasına aktarın ve canlı hücrelerin sayısını sayın. Hücre oturmadan hemen önce, mikro EF'nin tüm kuyularından laminini çıkarın. Daha sonra, aksonal bölmenin her kuyuya küçük hacimli süpernatant ortamı ekleyin.
Yavaşça somal bölmeye hücre süspansiyon beş mikrolitre tohum. Hücrenin substrata bağlanmasına izin vermek için bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Bir saat sonra, yavaşça sıcak takviyeli orta ile her iyi doldurun.
Hücre ayrılmasını önlemek için küçük hacimler ekleyin. Daha sonra mikro EF'yi bir kuluçka makinesine aktarın. Burada beş gün in vitro bir kültür gösterilir.
Bir hafta sonra, kültürler spontan aktivite sergilemeye başlar. Kayıtları gerçekleştirmeden önce, önceden amp yangın taban plakasını yemek için bir sıcaklık kontrol cihazı kullanın. Daha sonra mikro EF'yi preamplifikatörün üzerine yerleştirin ve kapağı kapatıp mandallayın.
Kaydetmek için, çok kanallı deneysel yazılımı açın. Örnekleme oranını 20 kilohertz'e ayarlayın. Filtreyi ve kaydedilmiş kutuları sürükleyin ve hem ham hem de filtrelenmiş verileri kaydetmek için bunları sırayla bağlayın.
Sinyalleri görselleştirmek ve hızlı kayıt için veri toplamayı başlatın. Kaydedilen veriler çok kanallı çözümleyici kullanılarak hızlı bir şekilde incelenebilir. Burada, mikrooluklar boyunca sinyal yayılımı zaten açıktır.
Bu yayılan olayları tanımlamak ve karakterize etmek için, mikro başak avcısı nda kaydınızı açın. Kayıt ayarlarına erişmek için dosya bilgileri düğmesini tıklatın ve analiz için mikro elektrotlar kümesini seçin. Olay algılamayı yaymak için eşiği ayarlayın.
Ve hızlı okuma verileri. Yazılım, algılanan tüm dizileri listeleyecek. Kullanıcı daha sonra bilgi olarak yayılma hızı değerlendirebilirsiniz, mikro elektrot çiftleri arasında, ve inter mesafe ve çapraz korelasyon dayalı.
Kemoterapi grafiği aracı, kullanıcının yayılma hızını el ile tahmin etmesini sağlar. Burada bir yayılma olayı gösterilir. Bir mikro oluk içinde dört mikro elektrot boyunca tespit edildi.
Bu olaylar bir Rasser komplo içinde temsil edilebilir. Burada kayıt ilk iki dakika için 11 mikrooluklar boyunca yayılma etkinliğidir. Yüksek ve düşük aktivitemikrooluk saygıyla, sarı ve kırmızı renklidir.
11 mikrooluk boyunca aktivitesenkronizasyonu dikkat edin. Eşitleme, etkinlik hızından bağımsızdır. İki mikrooğun anlık atış hızının değişimlerinde de görüleceği gibi.
Mikrooluklar aynı zamanda kutuda ve bıyık çiziminde gösterildiği gibi aksonal sinyal amplifikatörleri olarak da işlev görürler. Mikro akışkanları MEA'larla nasıl birleştirdiğinizi ve nöronları nasıl kültüre satabileceğinizi gösterdik. Ayrıca, nasıl kaydetmek ve bu kayıtlardan anlamlı veri ayıklamak için.
Bu gösterinin araştırmanız için yararlı olacağını umuyoruz, neden sinir devrelerinde iletişimi incelemek isteyebilirsiniz.
