ללא פרוטוקול, ניתן לחקור את התהליך הדינמי של ההתברות myoblast ואת היווצרות myofiber, במיוחד מיקום גרעיני על ידי ניצול הדמיה של תאים חיים. הדמיית תאים חיים של מיובלסט עם גרעיני תאים זרים מאפשרת לחקור את ההתבוללות myoblast בתאים חיים ואת המעקב האוטומטי של הגרעינים. הדגמה חזותית מסייעת בהבנה כיצד לשלב בידוד תאים ראשי עם הדמיה חיה וניתוח הדמיה.
הדגמת ההליך עם פרדריקה קולומבו, תהיה ג'ורגה קרצ'יה, דוקטורנט במעבדה שלנו. התחל על ידי קצירת סוליוס tibialis, extensor digitorum longus, gastrocnemius, quadriceps, ואת שרירי תלת ראשי משני הגפיים האחוריות של עכבר בוגר לתוך צלחת פטרי של PBS על קרח. השתמש מספריים סטריליים פינצטה להסיר בזהירות את הגידים והשומן מכל שריר ולהעביר את השרירים לתוך צלחת פטרי ריקה.
באמצעות מספריים מעוקל סטרילי לחתוך טחון השרירים עד מסה אחידה מתקבלת ולהעביר את חתיכות השריר לצינור 50 מיליליטר. לאחר מכן מוסיפים 10 מיליליטר של עיכול בינוני לחתיכות השריר עבור דגירה 30 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ב 250 סיבובים לדקה. בסוף העיכול האנזימטי, לעצור את התגובה עם 10 מיליליטר של מדיום חסימה.
ולסובב את הדגימה על ידי צנטריפוגה. מניחים את הצינור על קרח ומעבירים את העל-טבעי לצינור חדש של 50 מיליליטר. צנטריפוגה העל-טבעית שוב.
ולהשעות מחדש את גלולה במילימטר אחד של DMEM. להשלים אותו עם עשרה אחוזים סרום בקר עוברי, או FBS, על קרח. לעכל את גלולה שמורות 10 מיליליטר של מדיום עיכול טרי כפי שהוכח רק ולשלב את גלולה מתעכל עם ההשעיה תא מילואים, על קרח.
מסננים את התאים שנמשכו דרך מסנן 70 מיקרומטר, ואחריו מסנן 40 מיקרומטר. ולשטוף את התאים ב 15 מילימטרים של DMEM טרי, בתוספת 10 אחוז FBS. בסוף הצנטריפוגה, להשעות מחדש את גלולה בשלושה מיליליטר של חיץ תמוגה תא דם אדום בטמפרטורת החדר.
עצירת תמוגה לאחר חמש דקות עם 40 מיליליטר של PBS וצנטריפוגה נוספת. להשעות מחדש את גלולה ב 20 מיליליטר של DMEM בתוספת 10 אחוז FBS מראש צלחת התאים בצלחת פטרי מצופה. לאחר שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני לאסוף את תא הלווין המכיל על טבעי.
ו pre-plate ההשעיה התא פעמיים נוספות כפי שהודגם. לאחר הציפוי האחרון, לאסוף את תאי הלוויין על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה ב 40 מיליליטר של מדיום התפשטות טרי. לפצל את התאים בין שני קולגן מצופה 150 מיליליטר צלחות פטרי עם מיקרוגרם אחד למיליליטר של דוקסיציקלין לכל מנה כדי לגרום לביטוי H2BGFP.
ולהחזיר את התאים לאינקובטור תרבות התא במשך יומיים או שלושה. כאשר myoblasts הגיעו לצפיפות הניסוי המתאימה, לשטוף את התאים בכל מנה עם חמישה מיליליטר של PBS ולנתק את התאים מתחתית הצלחת עם שני מיליליטר של טריפסין למנה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. אשר ניתוק על ידי מיקרוסקופ אור ולעצור את התגובה עם חמישה מיליליטר של DMEM ועוד עשרה אחוז FBS לכל צלחת.
להדמיית תאים חיים, צלחת פעמיים עשר לתאים החמישיים לתוך כל באר של 12 צלחת גם מצופה 350 microliters של מדיום בידול, בתוספת מטריצת קרום מרתף ל הבאר במשך שעתיים. כאשר התאים דבקו בחלק התחתון של הצלחת, מניחים את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני אינקובטור על שלב מיקרוסקופ קונפוקלי ולהשתמש במטרה יבשה 20 פעמים כדי להשיג שדות תצוגה עם מאות תאים לרכוש תמונות 16 סיביות עם 1024 על ידי 1024 פיקסלים למסגרת כל שש דקות במשך 16 שעות. עבור כל מיקום שנרכש, ליצור קובץ tif נקודה מסגרת מרובה ולהוריד ולחלץ את תוכנת zip נקודה המסופקת בתיקיה שנבחרה.
פתח את הדוגמה של תיקיית מעקב אחר פילוח ולחץ על בצע פילוח נקודה M כדי לפתוח את חלון הפקודה ב- Matlab. שנה את קבצי ה- Script של נקודה M של פילוח התשלום כך שהרצועה של שם קובץ המשתנה היא שם קובץ ה- tif ומסלול הקלט של הנתיב היא התיקיה שבה ה- dot tif כלול. לחץ על הפעל כדי להפעיל את קובץ ה- Script.
תוצאת הפילוח תישמר כמחצלת נקודה של קובץ, בעוד שניתן יהיה לדמיין את פילוח הגרעינים בנתון הפלט. כדי ליצור את הרצועות, לחץ תחילה פעמיים על צור רצועות נקודה M באותה תיקיית עבודה. לאחר מכן, שנה את שם הקובץ לנקודת שם הקובץ את קובץ הנקודה Mat המתאים עבור הגרעינים המקטעים.
לחץ על הפעל כדי להפעיל את קובץ ה- Script. תוצאת המעקב תישמר כקובץ מחצלת נקודה אחר והרצועות שנוצרו יתוותו. כדי להעריך את איכות הרצועות.
תחילה לחץ פעמיים על סימן המעקב אחר שיק M ושנה את שם הקובץ לשם tif המתאים. לאחר מכן לחץ על רצועת שם קובץ כדי להשתמש בקובץ מחצלת הנקודות של הרצועות ולחץ על הפעל. בחלון הדמות השתמש בפס הגלילה התחתון כדי לבחור בגרעין.
הגרעין שנבחר יהיה מוקף בעיגול באדום, ואת המסלול של התא הנבחר ניתן לעקוב בזמן באמצעות פס הגלילה העליון. צלבים ירוקים מצביעים על הגרעינים שזוהו. התפשטות והתמדה נפגעים מאוד ב myoblasts מתורבת עם Hoechst.
בהשוואה למיובלסט המבודד מעכברי H2BGFP ומתורבת עם דוקסיציקלין או סוג פראי, מיוסין שרשרת כבדה שכותרתו myoblasts. הדמיה של תאים חיים עם מיובלסטים ראשוניים המבטאת את חלבון H2BGFP מאפשרת מעקב אחר הגרעינים במהלך ההידול. תמונות ממוזגות של שידור בערוצי GFP בנקודות הזמן הראשוניות והסופיות של תקופת ההידול, מאפשרות זיהוי של מיוטובים וכתוצאה מכך גרעינים שבסופו של דבר משתלבים במיאוטובות או שלא מתמזגים לתוך מיוטובים.
לאחר הדמיה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקאלית, ניתן לקטע את הגרעינים כפי שהוכח והפיכת קו פרשת המים יכולה לשמש להפרדת עצמים סמוכים. בגישה זו, רוב הגרעינים מזוהים בתמונה, ומאפשרים מעקב אחר תנועת הגרעינים כפי שהוכח. לדוגמה, נראה כי האורך הכולל של המסלולים הוא מעט גבוה יותר עבור תאים מוכתמים Hoechst.
למרות שההבדל אינו משמעותי. עם זאת, חישוב של התזוזה הכוללת במהלך זמן לשגות מגלה כי התזוזה הכוללת של התאים מוכתמים Hoechst הוא קטן באופן משמעותי מזה של תאים נגועים. כפי שחזו את השונות השנתית הכוללת עבור התאים שאינם נגועים הוא קטן באופן משמעותי בהשוואה לתאים מוכתמים עם Hoechst.
חשוב לעקוב אחר הפרוטוקול בדיוק כפי שהוכח במיוחד כאשר משלבים את הכישורים הטכניים מהשלבים הביולוגיים עם מיקרוסקופ קונפוקל ותוכנה בשימוש בשלבים. כדי ללמוד את ההתברמות myoblast ומיצוב גרעיני במודל שריר אחר של עניין ניתן להעביר מיובלסט מבודד עם חלבון גרעיני פלואורסצנטי. טכניקה זו סללה את הדרך לחקור את הדינמיקה התאית והגרעין במהלך דידול שרירים ולחקור עוד יותר פגמים בתהליכים אלה.
בתנאים פתולוגיים שונים כגון דיסטרופות שרירים.
