פרוטוקול זה מתאר את השיטה לאפיון מולקולרי מקיף ובלתי משוחד של מדגם יחיד באמצעות ספקטרומטריית מסה, באמצעות מטבולומיקה, פרוטומיקה וליפידמיקה, ופלטפורמות ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית. המשמעות של גישה זו היא שאנחנו יכולים לאפיין מערכת ביולוגית במורד הזרם של הגנום, באמצעות זיהוי סוגים שונים של מולקולות, המאפשר לנו להסיק מסלולים מטבוליים פירוק. טכניקת מיצוי רציפה, לאפשר מיצוי של bioavailable, תרכובות קוטב באמצעות מים, ואחריו MPLEx כדי ללכוד כל תרכובות קוטביות נוספות או מטבוליטים, כמו גם חלבונים ושומנים מדגם אחד.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית משום שהיא מנחה את המדען באמצעות הפרדת שלוש השכבות במהלך שלב החילוץ השני, ופיצול התמציות בין מכשירי ניתוח שונים. ניתוחים רב-אטומיים אינטגרטיביים מעצימים חקירות יעילות יותר והבנה מלאה של מערכות ביולוגיות מורכבות. שיטה חזקה זו מחלצת מגוון רחב של מולקולות והיא ישימה לסוגי מדגם מגוונים.
התחל הליך זה עם איסוף והכנת הדגימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. באמצעות אתנול שטף, כלי נירוסטה, aliquot 50 מיליגרם של כל דגימות מיובשות לתוך צינורות זכוכית בודדים שני מיליליטר. מוסיפים מיליליטר אחד של מים מזוקקים, מנוגזים לכל מדגם.
לאחר מכן מכסים את הבקבוקונים ומנערים במשך שעתיים על שולחן שייקר. צנטריפוגה הדגימות ב 15,000 פעמים כבידה במשך 30 דקות. ואז לאפשר את הפתרונות לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
Decant ולשמור את supernatant מכל מדגם. לנהל מיצוי MPLEx על שאריות עכשיו מים שחולצו על ידי חזרה על שלבי החילוץ האלה. מלבד להחליף מינוס 20 מעלות צלזיוס ארבע עד שלוש כלורופורם לתערובת מתנול למים מזוקקים, degassed.
בזהירות להפריד את שתי שכבות ממס וכתוצאה מכך, אשר יהיה להבחין חזותית באמצעות הסרת השכבה העליונה על ידי צינור זהיר. מייבשים את השכבה התחתונה שאינה קוטבית במייבש ההקפאה. ברגע שהוא יבש, להוסיף חמישה microliters של כלורופורם ו 195 microliters של מתנול אם מנתחים בתוך הימים הקרובים.
כדי לשפר את יעילות יינון electrospray עבור ספקטרומטריית מסה תהודה יון גוון ארבע טרנספורמציה, קיצור FTICR-MS על ידי הזרקה ישירה. מדללים את תמצית הכלורופורם אחד לאחד במתנול, ואת תמצית המים 2 ל-1 במתנול. כייל את ספקטרומטר FTICR על ידי הזרקת 100 מיקרוליטרים ישירות של פתרון כוונון, המשתרע על פני טווח מסה של כ 100 עד 1, 300 דלתונים, לתוך FTICR-MS.
הזרקה ישירה 100 מיקרוליטרים של תקן חומצה פולבית נהר Suwannee למקור יינון electrospray. יחד עם ספקטרומטר FTICR באמצעות משאבת מזרק שנקבעה לקצב זרימה של 3.0 מיקרוליטר לדקה. הגדר את מתח המחט לחיובי 4.4 קילו-וולט.
תור אחד עד 100 מסה כדי לטעון יחס נימי זכוכית ב 180 מעלות צלזיוס. בדוק את הספקטרום שנוצר באמצעות תוכנת הניתוח כדי לאשר את איכות הנתונים. עכשיו, להציג 100 microliters של כל תמצית באמצעות הזרקה ישירה למקור יינון electrospray, יחד עם ספקטרומטר FTICR באמצעות משאבת מזרק להגדיר קצב זרימה של 3.0 microliters לדקה.
הגדר את הפרמטרים כבעבר. התאם את זמן הצטברות היונים עבור כל מדגם או קבוצת דגימות כדי להסביר את השונות בריכוז הפחמן. לאסוף 144 סריקות עבור כל מדגם, ממוצע הסריקות ולאחר מכן לבצע כיול פנימי באמצעות סדרת CH2 הומולוגית.
יבש את התמציות באמצעות רכז ולשמור את שאר התמציות עבור ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה גז הבאים, ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה נוזלית וניתוח ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית. כדי להתכונן ל- GC-MS, הכן תחילה דוגמאות פקד ריק כמפורט בפרוטוקול הטקסט. כדי להגן על קבוצות קרבינול להוסיף 20 microliters של 30 מיליגרם לכל מיליליטר methoxamine הידרוכלוריד ב Paradyne לכל הדגימות, כולל תמציות מתנול, תמציות מים, החסר ואת דגימות כיול FAME.
לאטום את הבקבוקונים עם כובעים. Vortex התמציות במשך 20 שניות, ולאחר מכן sonicate התמציות במשך 60 שניות. צנטריפוגה תמציות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות ב 100 פעמים כוח הכבידה.
הוסף 80 מיקרוליטרים של MSTFA עם 1%trimethylchlorosilane לכל מדגם. לאחר מערבולת sonicating התמציות כמו קודם, צנטריפוגה תמציות שוב ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ב 100 פעמים כוח הכבידה. לאחר קירור תמציות לטמפרטורת החדר, להעביר לתוך בקבוקונים GC-MS מדגם אוטומטי.
המשך לניתוח GC-MS ועיבוד נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להתכונן לניתוח NMR מצב נוזלי, לדלל את שאר תמציות המים על ידי 10% עם תקן פנימי DSS חמישה מילימולרים. מעבירים את התערובת לצינור NMR מזכוכית בורוסיליקט בקוטר 3 מ"מ באיכות גבוהה.
המשך לניתוח NMR ועיבוד נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לבצע את ניתוח ליפידמיקה LC-MS, להזריק 10 microliters של כל תמצית לתוך מערכת כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים אולטרה, יחד עם ספקטרומטר מסה Orbitrap באמצעות עמודה היברידית משטח טעון שלב הפוך. הגדר מעבר צבע של 34 דקות כמפורט בפרוטוקול הטקסט בקצב זרימה של 250 מיקרוליטר לדקה.
השתמש הן במצבי יינון שליליים והן במצבי יינון חיוביים עם דיסוציאציה גבוהה יותר של התנגשות אנרגיה ודיסוציאציה הנגרמת על-ידי התנגשות. כדי לבצע ניתוח פרוטומיקה, ראשית לחלץ חלבונים על פי פרוטוקול MPLEx לשארית שלב המתנול כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כבול הושווה עם עומק בביצה S1 ב Spruce ו Peatlands תגובה תחת סביבות משתנות או אתר SPRUCE במינסוטה, ארה"ב.
3, 312 אנזימים זוהו בניתוח פרוטומיקה. ניתוח של פעילות האנזים בעומק מגלה כי מספר האנזימים יורד בחדות בין 15 ס"מ ל -45 ס"מ בביג SPRUCE. כדי להראות כיצד אתרים עשויים להשתנות בפעילויות מטבוליט ואנזים, תוצאות SPRUCE מושווים לאלה של בוג ופן פרמפרווסט בצפון שוודיה.
בסך הכל 67, 040 מטבוליטים זוהו בכל דגימות כבול SPRUCE מהשילוב של FTICR-MS, NMR, GC-MS ו LC-MS ניתוחים. מוצג כאן החלק היחסי של מעמדות כימיים שונים שזוהו באמצעות טכניקות שונות במעמקים השונים. בעוד חומצות אמינו וסוכרים לרדת עם עומק, זה לא נצפתה עבור שומנים.
על ידי אימות צולב מטבוליטים שזוהו בכל הניתוחים נגד מסד הנתונים KEGG נקבע כי התרכובות שזוהו מעורבים במסלולים מטבוליים נפוצים כגון מחזור חומצה טריקרבוקסילית, גליקוליזה ומטבוליזם סוכר. לאורך הליך זה חיוני להיות מודע למקורות פוטנציאליים של זיהום. החל באיסוף מדגם באמצעות ניתוח, דגימות לא צריך לבוא במגע עם פלסטיק pegged אשר יכול להשפיע לרעה על יינון.
רבים מהממסים המשמשים במהלך הליך החילוץ מסוכנים או דליקים. תמיד ללבוש PPE המתאים כדי למנוע מגע עור ועין, כמו גם כדי למנוע דגימות מזהמים.
