Este protocolo descreve o método para caracterização molecular abrangente e imparcial de uma única amostra usando espectrometria de massa, usando plataformas de metabolômica, proteômica e lipidômica, e plataformas de espectroscopia de ressonância magnética nuclear. O significado dessa abordagem é que podemos caracterizar um sistema biológico a jusante do genoma, através da identificação de diferentes tipos de moléculas, permitindo-nos inferir vias metabólicas e decomposição. Técnica de Extração Sequencial, permitir a extração de compostos polares biodisponíveis usando água, seguido por MPLEx para capturar quaisquer compostos polares adicionais ou metabólitos, bem como proteínas e lipídios de uma única amostra.
A demonstração visual deste método é fundamental porque orienta o cientista através da separação das três camadas durante a segunda etapa de extração, e da divisão dos extratos entre diferentes instrumentos de análise. Análises multimicômicas integrativas capacitam investigações mais eficazes e compreensão completa de sistemas biológicos complexos. Este método robusto extrai uma ampla diversidade de moléculas e é aplicável a diversos tipos de amostras.
Inicie este procedimento com coleta e elaboração das amostras conforme descrito no protocolo de texto. Usando um utensílio de aço inoxidável lavado, aliquot 50 miligramas de cada uma das amostras secas em dois tubos de vidro mililitros individuais. Adicione um mililitro de água destilada e desgaseada a cada amostra.
Em seguida, tampe os frascos e agite por duas horas em uma mesa de agitação. Centrifugar as amostras a 15 mil vezes a gravidade por 30 minutos. E então permitir que as soluções fiquem em temperatura ambiente por 20 minutos.
Decante e salve o supernaente de cada amostra. Realize uma Extração MPLEx nos resíduos extraídos agora de água repetindo essas etapas de extração. Exceto para substituir um menos 20 graus celsius de quatro a três clorofórmio à mistura de metanol para a água destilada e desgasegada.
Separe cuidadosamente as duas camadas de solventes resultantes, que serão visualmente distinguíveis através da remoção da camada superior por tubulação cuidadosa. Seque a camada não polar inferior no secador congelador. Assim que estiver seco, adicione cinco microliters de clorofórmio e 195 microliters de metanol se analisar nos próximos dias.
Para melhorar a eficiência de ionização de eletrospray para a espectrometria de massa de ressonância ciclotron de íons de ion de ion fourier-transform, abreviado FTICR-MS por injeção direta. Diluir o extrato de clorofórmio de um a um em metanol, e a água extrair dois a um em metanol. Calibrar o espectrômetro FTICR injetando diretamente 100 microliters de uma solução de ajuste, abrangendo uma faixa de massa de aproximadamente 100 a 1.300 daltons, no FTICR-MS.
Injete 100 microlitres do padrão Suwannee River Fulvic Acid à fonte de ionização de eletrospray. Acoplado ao espectrômetro FTICR através de uma bomba de seringa definida para uma taxa de fluxo de 3,0 microliters por minuto. Coloque a tensão da agulha em 4,4 quilovolts positivos.
Enfileirar de uma a 100 massas para a taxa de carga e o capilar de vidro a 180 graus celsius. Inspecione os espectros resultantes usando o software de análise para confirmar a qualidade dos dados. Agora, introduza 100 microliters de cada extrato via injeção direta na fonte de ionização de eletrospray, acoplado ao espectrômetro FTICR através de uma bomba de seringa definida para uma taxa de fluxo de 3,0 microliters por minuto.
Defina os parâmetros como antes. Ajuste o tempo de acumulação de íons para cada amostra ou grupo de amostras para explicar a variação na concentração de carbono. Colete 144 scans para cada amostra, faça uma média dos exames e, em seguida, realize uma calibração interna usando uma série CH2 homólogo.
Seque os extratos usando um concentrador e salve o restante dos extratos para espectrometria de massa de cromatografia gasosa subsequente, espectrometria de massa cromatografia líquida e análise de espectroscopia de ressonância magnética nuclear. Para se preparar para o GC-MS, primeiro prepare amostras de controle em branco conforme detalhado no protocolo de texto. Para proteger os grupos de carbinol, adicione 20 microlitadores de 30 miligramas por cloridrato de methoxamina mililitro em Paradyne a cada uma das amostras, incluindo os extratos de metanol, os extratos de água, os espaços em branco e as amostras de calibração FAME.
Sele os frascos com tampas. Vórtice os extratos por 20 segundos, em seguida, sonicar os extratos por 60 segundos. Centrifugar os extratos a 37 graus celsius por 90 minutos a 100 vezes a gravidade.
Adicione 80 microliters de MSTFA com 1%trimtilcloosilano em cada amostra. Após vórtices e sonicar os extratos como antes, centrifugar os extratos novamente a 37 graus celsius por 30 minutos a 100 vezes a gravidade. Após o resfriamento extratos para temperatura ambiente, transfira para frascos de autosampler GC-MS.
Proceda à análise e processamento de dados do GC-MS conforme descrito no protocolo de texto. Para se preparar para a análise de RMR de estado líquido, diluir o restante dos extratos de água em 10% com um padrão interno DSS de cinco mililitros. Transfira a mistura para um tubo NMR de vidro de três milímetros de diâmetro externo de três milímetros.
Proceda à análise de RMN e ao processamento de dados conforme descrito no protocolo de texto. Para realizar a análise lipidomica LC-MS, injete 10 microliters de cada extrato em um sistema de cromatografia líquida de ultra desempenho, acoplado a um espectrômetro de massa Orbitrap usando uma coluna híbrida de superfície carregada de fase invertida. Defina um gradiente de 34 minutos conforme listado no protocolo de texto a uma taxa de fluxo de 250 microliters por minuto.
Use modos de ionização negativos e positivos com maior dissociação de colisão de energia e dissociação induzida por colisão. Para realizar a análise da proteômica, primeiro extrair proteínas de acordo com o protocolo MPLEx para o restante da fase do metanol, conforme descrito no protocolo de texto. Peat foi comparado com a profundidade no pântano S1 no Spruce and Peatlands Response Under Changing Environments ou SPRUCE site em Minnesota, EUA.
3.312 enzimas foram identificadas na análise proteômica. Uma análise das atividades enzimárias com profundidade revela que o número de enzimas diminui acentuadamente entre 15 centímetros e 45 centímetros no Pântano SPRUCE. Para mostrar como os locais podem variar em atividades metabólitos e enzimas, os resultados do SPRUCE são comparados aos de um Permafrost Bog e Fen no norte da Suécia.
Ao todo foram identificados 67.040 metabólitos em todas as amostras de Turfa SPRUCE a partir da combinação de análises FTICR-MS, NMR, GC-MS e LC-MS. Mostrada aqui é a fração relativa de diferentes classes químicas identificadas através de várias técnicas nas diferentes profundidades. Enquanto aminoácidos e açúcares diminuem com profundidade, isso não é observado para lipídios.
Ao validar metabólitos cruzados identificados em todas as análises contra o Banco de Dados KEGG foi determinado que os compostos identificados estão envolvidos em vias metabólicas comuns, como ciclo de ácido tricarboxílico, glicolise e metabolismo de açúcar. Ao longo deste procedimento é fundamental estar atento às possíveis fontes de contaminação. A partir da coleta de amostras por meio da análise, as amostras não devem entrar em contato com plásticos atrelados que podem afetar negativamente a ionização.
Muitos dos solventes utilizados durante o procedimento de extração são perigosos ou inflamáveis. Use sempre EPI apropriado para evitar o contato com a pele e o contato visual, bem como para evitar contaminar amostras.
