用于表征复杂天然有机物混合物的单吞吐量互补高分辨率分析技术

该协议描述了使用质谱法对单个样品进行综合、无偏分子表征的方法，使用代谢组学、蛋白质组学和唇部学法，以及核磁共振光谱学平台。这种方法的意义是，我们可以通过识别不同类型的分子来描述基因组下游的生物系统，使我们能够推断代谢和分解途径。顺序提取技术，允许利用水提取生物可利用的极性化合物，然后MPLEx从单个样品中捕获任何其他极性化合物或代谢物以及蛋白质和脂质。

这种方法的可视化演示至关重要，因为它指导科学家在第二次提取步骤中分离三层，并在不同的分析仪器之间分离提取。综合多生物分析能够更有效地调查和全面了解复杂的生物系统。这种稳健的方法提取了多种分子，适用于多种样品类型。

从收集并准备示例开始此过程，如文本协议中所述。使用乙醇洗涤，不锈钢器具，等价50毫克，每个干燥的样品到单独的两毫升玻璃管。在每个样品中加入一毫升蒸馏、脱气水。

然后盖上小瓶，在摇床桌上摇动两个小时。将样品在重力15000倍时离心30分钟。然后让溶液在室温下站立20分钟。

从每个样品中抽取并保存上一个样本。通过重复这些提取步骤，对现在提取的水提取残留物进行 MPLEx 提取。除了用零下20摄氏度的4至3个氯仿代替甲醇混合物作为蒸馏的脱气水。

小心地分离两个产生的溶剂层，通过仔细移液去除顶层，可以直观地区分。干燥冷冻干燥机中的下部非极性层。一旦干燥，如果在未来几天内分析，添加5微升氯仿和195微升甲醇。

为了提高四变离子回振质谱的电喷电离效率，通过直接喷射缩写了FTICR-MS。将氯仿提取物在甲醇中稀释一对一，水在甲醇中萃取二对一。通过直接将 100 微升调谐溶液（跨越大约 100 至 1，300 道尔顿）的质量范围注入 FTICR-MS 来校准 FTICR 光谱仪。

直接向电喷电离源注入100微升苏万尼河富尔维克酸标准。通过注射器泵与 FTICR 光谱仪耦合，流量设置为每分钟 3.0 微升。将针电压设置为正 4.4 千伏。

排队 1 到 100 质量充电比和玻璃毛细管在 180 摄氏度。使用分析软件检查生成的光谱，以确认数据的质量。现在，通过直接喷射将每个提取物的100微升引入电喷电离源，通过注射器泵将FTICR光谱仪耦合到每分钟3.0微升的流速。

将参数设置为以前一样。调整每个样品或一组样品的离子积累时间，以考虑碳浓度的变化。收集每个样品的 144 次扫描，平均扫描，然后使用同源 CH2 系列进行内部校准。

使用浓缩器干燥提取物，并保存其余提取物，以便随后进行气相色谱质谱法、液相色谱质谱法和核磁共振光谱分析。若要准备 GC-MS，请先准备文本协议中详述的空白控件示例。为了保护卡宾诺组，在每一个样品中加入20微升，每毫升甲氧胺30毫克，包括甲醇提取物、水提取物、空白和 FAME 校准样品。

用瓶盖密封小瓶。漩涡提取物20秒，然后声波提取物60秒。在37摄氏度下将提取物在100倍重力下离心90分钟。

在每个样品中加入 80 微升 MSTFA，其中 1%为三氯硅烷。在像以前一样对提取物进行涡旋和声波后，在37摄氏度下再次将提取物在100倍重力下离心30分钟。将提取物冷却至室温后，转移到GC-MS自动采样器小瓶中。

按照文本协议中所述，继续进行 GC-MS 分析和数据处理。为准备液状态 NMR 分析，使用 5 毫摩尔 DSS 内部标准将剩余的水提取物稀释 10%。将混合物转移到一个高质量的三毫米外径硅酸盐玻璃 NMR 管中。

按照文本协议中所述，继续进行 NMR 分析和数据处理。为了执行LC-MS唇部分析，将每种提取物的10微升注入超高性能液相色谱系统中，并结合使用反相带电表面混合柱的轨道拉普质谱仪。以每分钟 250 微升的流速设置文本协议中列出的 34 分钟渐变。

使用负电离和正电离模式，具有较高的能量碰撞分离和碰撞引起的分离。要执行蛋白质组学分析，首先根据MPLEx协议提取蛋白质，以完成文本协议中概述的甲醇相剩余的部分。将泥炭与美国明尼苏达州云杉和泥炭地环境变化或云杉场的S1沼泽的深度进行比较。

在蛋白质组学分析中确定了3，312种酶。对深度酶活性的分析表明，在云杉博格中，酶的数量急剧下降在15厘米到45厘米之间。为了显示在代谢物和酶活性中站点如何变化，SPRUCE 的结果与瑞典北部的永久变形博格和芬的结果进行比较。

从 FTICR-MS、NMR、GC-MS 和 LC-MS 分析的组合中，在所有云杉泥炭样品中共发现了 67，040 种代谢物。这里展示的是不同深度通过各种技术识别的不同化学类的相对部分。虽然氨基酸和糖随着深度而下降，但脂质则未观察到这一点。

通过交叉验证所有分析中针对 KEGG 数据库的代谢物，确定所鉴定的化合物涉及常见的代谢途径，如三叶酸循环、糖解和糖代谢。在整个过程中，了解潜在的污染源至关重要。从样品采集开始分析，样品不应与会对电离产生负面影响的固定塑料接触。

在萃取过程中使用的许多溶剂都是危险或易燃的。始终佩戴适当的 PPE，以避免皮肤和眼神接触，以及避免污染样品。