Bu protokol, metabolomik, proteomik ve lipidomik ve nükleer manyetik rezonans spektroskopi platformları kullanılarak tek bir numunenin kapsamlı, tarafsız moleküler karakterizasyonu yöntemini açıklamaktadır. Bu yaklaşımın önemi, farklı molekül türlerini tanımlayarak, metabolik ve ayrışma yollarını çıkarabilmek için genomun aşağısındaki biyolojik sistemi karakterize edebilmemizdir. Sıralı Ekstraksiyon Tekniği, biyomevcut ekstraksiyon sağlar, su kullanarak kutup bileşikleri, MPLEx tarafından takip herhangi bir ek polar bileşikler veya metabolitler yanı sıra proteinler ve lipidler tek bir örnekten yakalamak için.
Bu yöntemin görsel gösterimi önemlidir, çünkü bilim adamına ikinci çıkarma adımında üç katmanı ayırarak ve özleri farklı analiz araçları arasında bölerek yönlendirir. İntegratif çoklu omik analizler, daha etkili araştırmaları ve karmaşık biyolojik sistemlerin tam olarak anlaşılmasını sağlar. Bu sağlam yöntem moleküllerin geniş bir çeşitlilik ayıklar ve çeşitli örnek türleri için geçerlidir.
Bu yordamı metin protokolünde açıklandığı gibi örneklerin toplanması ve hazırlanması ile başlayın. Bir etanol yıkanmış kullanarak, paslanmaz çelik mutfak eşyaları, aliquot 50 tek tek iki mililitre cam tüpler içine kurutulmuş örneklerin her miligram. Her numuneye bir mililitre distile, gazdan arındırılmış su ekleyin.
Sonra şişeleri kap ve bir shaker masada iki saat sallayın. Örnekleri 30 dakika boyunca 15 bin kat yerçekiminde santrifüj edin. Ve sonra çözeltiler oda sıcaklığında 20 dakika bekletin.
Decant ve her örnekten supernatant kaydedin. Bu ekstraksiyon adımlarını tekrarlayarak, şimdi su çıkarılan artıklar üzerinde bir MPLEx Ekstraksiyon gerçekleştirin. Distile, gazdan arındırılmış su için metanol karışımına eksi 20 derece lik 4-3 kloroform yerine başka bir şey.
Dikkatli borulama ile üst tabaka kaldırarak görsel olarak ayırt edilebilir olacak iki ortaya çıkan solvent katmanları, dikkatle ayırın. Dondurucu kurutucuda alt kutup tabakasını kurutun. En kısa sürede kuru olarak, kloroform beş mikrolitre ve metanol 195 mikrolitre ekleyin eğer önümüzdeki birkaç gün içinde analiz.
Fourier-transform iyon sikloron rezonans kütle spektrometresi için elektrosprey iyonizasyon verimliliğini artırmak için, doğrudan enjeksiyon ile FTICR-MS kısaltılmış. Kloroform ekstresini metanolde bire bir seyreltin ve su metanolde ikiye bir. FTICR spektrometresini, yaklaşık 100 ila 1, 300 daltonluk bir kütle aralığını FTICR-MS'e doğrudan 100 mikrolitre lik bir ayarlama çözeltisine enjekte ederek kalibre edin.
Doğrudan enjekte 100 Suwannee Nehri Fulvik Asit standart elektrosprey iyonizasyon kaynağına mikrolitre. Dakikada 3.0 mikrolitre akış hızına ayarlanmış bir şırınga pompası ile FTICR spektrometresine birleştiğinde. İğne voltajını 4,4 kilovolt pozitife ayarlayın.
1'den 100'e kadar kütleşarj oranı ve cam kılcal damarı 180 santigrat derece. Verilerin kalitesini doğrulamak için analiz yazılımını kullanarak ortaya çıkan spektrumları inceleyin. Şimdi, elektrosprey iyonizasyon kaynağına doğrudan enjeksiyon yoluyla her özün 100 mikrolitre tanıtmak, dakikada 3.0 mikrolitre akış hızı ayarlanmış bir şırınga pompası ile FTICR spektrometre ile birleştiğinde.
Parametreleri eskisi gibi ayarlayın. Karbon konsantrasyonundaki değişimi hesaba katmak için her numune veya numune grubu için iyon birikim süresini ayarlayın. Her numune için 144 tarama toplayın, taramaları n ortalamasını alın ve homolog CH2 serisi kullanarak dahili kalibrasyon gerçekleştirin.
Bir konsantratör kullanarak özleri kurulayın ve sonraki gaz kromatografisi kütle spektrometresi, sıvı kromatografi kütle spektrometresi ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi için özlerin geri kalanını kaydedin. GC-MS'e hazırlanmak için önce metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi boş denetim örnekleri hazırlayın. Karbinol gruplarını korumak için paradyne mililitre metoksamin hidroklorür başına 20 mikrolitre eklemek her örnek, metanol özleri de dahil olmak üzere, su ekstreleri, boşluklar ve FAME kalibrasyon örnekleri.
Şişeleri kapaklı mühürleyin. 20 saniye boyunca özleri girdap, sonra 60 saniye boyunca özleri sonicate. 100 kat yer çekiminde 90 dakika boyunca 37 derecede özleri santrifüj edin.
Her numuneye %1 trimetilklorosilane ile 80 mikrolitre MSTFA ekleyin. Daha önce olduğu gibi özleri girdap ve sonicating sonra, 100 kez yerçekimi 30 dakika boyunca 37 derece santigrat tekrar özleri santrifüj. Ekstreleri oda sıcaklığına kadar soğuttuktan sonra GC-MS otonumuner şişelerine aktarın.
Metin protokolünde açıklandığı gibi GC-MS analizine ve veri işlemeye devam edin. Sıvı hal NMR analizine hazırlanmak için, su ekstrelerinin geri kalanını beş milimolar DSS dahili standardı ile %10 oranında seyreltin. Karışımı yüksek kaliteli, üç milimetre dış çapborosilikat cam NMR tüpiçine aktarın.
Metin protokolünde açıklandığı gibi NMR çözümlemesi ve veri işlemeye devam edin. LC-MS lipidomik analizini gerçekleştirmek için, her ekstresin 10 mikrolitresini ultra performanslı sıvı kromatografi sistemine enjekte edin, ters faz yüklü yüzey hibrid kolonu kullanarak Orbitrap kütle spektrometresi ile birleştiğinde. Metin protokolünde listelenen 34 dakikalık bir degradeyi dakikada 250 mikrolitre akış hızında ayarlayın.
Daha yüksek enerji çarpışma ayrışması ve çarpışmaya bağlı ayrışma ile hem negatif hem de pozitif iyonlaşma modları kullanın. Proteomik analizi ni gerçekleştirmek için, metol fazının metin protokolünde belirtildiği gibi kalan kısmı için mplex protokolüne göre ilk protein özütün. Turba Sladin ve Minnesota, ABD'de SPRUCE site nin Değişen Ortamlar veya SPRUCE sitesinde Altında Peatlands Yanıt S1 bataklık derinliği ile karşılaştırıldı.
Proteomik analizde 3,312 enzim tespit edildi. Derinlik ile enzim faaliyetlerinin bir analiz enzim lerin sayısı spruce Bataklık 15 santimetre ve 45 santimetre arasında keskin bir düşüş olduğunu ortaya koymaktadır. Sitelerin metabolit ve enzim aktivitelerinde nasıl farklılık gösterebileceğini göstermek için, SPRUCE sonuçları Kuzey İsveç'teki Permafrost Bog ve Fen'dekilerle karşılaştırılır.
FTICR-MS, NMR, GC-MS ve LC-MS analizlerinin kombinasyonundan alınan Tüm SPRUCE Turba örneklerinde toplam 67.040 metabolit saptandı. Burada gösterilen farklı derinliklerde çeşitli teknikler ile tanımlanan farklı kimyasal sınıfların göreceli fraksiyonudur. Amino asitler ve şekerler derinlik ile düşüş iken, bu lipidler için gözlenmez.
KEGG Veritabanı'na yapılan tüm analizlerde tanımlanan metabolitlerin çapraz doğrulanması ile tanımlanan bileşiklerin trikarboksilik asit döngüsü, glikolive şeker metabolizması gibi ortak metabolik yollarda yer aldığı saptandı. Bu prosedür boyunca potansiyel kontaminasyon kaynaklarının farkında olmak çok önemlidir. Analiz yoluyla numune toplamadan başlayarak, numuneler iyonizasyonu olumsuz etkileyebilecek saptanmış plastiklerle temas etmemelidir.
Ekstraksiyon işlemi sırasında kullanılan çözücülerin çoğu tehlikeli veya yanıcıdır. Cilt ve göz temasından kaçınmak ve numuneleri kirletmemek için her zaman uygun PPE'yi takın.
