Questo protocollo descrive il metodo per una caratterizzazione molecolare completa e imparziale di un singolo campione usando sia la spettrometria di massa, usando metabolomica, proteomica e lipidomica, sia piattaforme di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare. Il significato di questo approccio è che possiamo caratterizzare un sistema biologico a valle del genoma, identificando diversi tipi di molecole, permettendoci di dedurre vie metaboliche e di decomposizione. Tecnica di estrazione sequenziale, consente l'estrazione di composti polari biodisponibili utilizzando acqua, seguita da MPLEx per catturare eventuali composti polari aggiuntivi o metaboliti, nonché proteine e lipidi da un singolo campione.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché guida lo scienziato attraverso la separazione dei tre strati durante la seconda fase di estrazione e la divisione delle estrazioni tra diversi strumenti di analisi. Le analisi multiomiche integrative consentono indagini più efficaci e una comprensione completa di sistemi biologici complessi. Questo metodo robusto estrae un'ampia varietà di molecole ed è applicabile a diversi tipi di campioni.
Iniziare questa procedura con la raccolta e la preparazione degli esempi come descritto nel protocollo di testo. Utilizzando un utensile in acciaio inossidabile lavato con etanolo, aliquota 50 milligrammi di ciascuno dei campioni essiccati in singoli due tubi di vetro millilitro. Aggiungere un millilitro di acqua distillata e degassata a ciascun campione.
Quindi limitare le fiale e agitare per due ore su un tavolo shaker. Centrifugare i campioni a 15 mila volte la gravità per 30 minuti. E poi lasciare che le soluzioni si fermino a temperatura ambiente per 20 minuti.
Decantare e salvare il supernatante da ogni campione. Condurre un'estrazione MPLEx sui residui ora estratti dall'acqua ripetendo queste fasi di estrazione. Tranne che per sostituire una miscela meno 20 gradi celsius da quattro a tre cloroformio con la miscela di metanolo per l'acqua distillata e degassata.
Separare accuratamente i due strati di solvente risultanti, che saranno visivamente distinguibili rimuovendo lo strato superiore mediante un'attenta pipettazione. Asciugare lo strato inferiore non polare nell'essiccatore a congelamento. Non appena è asciutto, aggiungere cinque microlitri di cloroformio e 195 microlitri di metanolo se si analizzano entro i prossimi due giorni.
Per migliorare l'efficienza di ionizzazione elettrospray per la spettrometria di massa a risonanza ciclotronica ionica a trasformata fourier, abbreviata FTICR-MS per iniezione diretta. Diluire l'estratto cloroformio uno a uno in metanolo, e l'acqua estrarre due a uno in metanolo. Calibrare lo spettrometro FTICR iniettando direttamente 100 microlitri di una soluzione di sintonizzazione, che si estende su un intervallo di massa di circa 100-1.300 daltoni, nell'FTICR-MS.
Iniettare direttamente 100 microlitri dello standard dell'acido fulvico del fiume Suwannee alla sorgente di ionizzazione elettrospray. Accoppiato allo spettrometro FTICR attraverso una pompa per siringhe impostata su una portata di 3,0 microlitri al minuto. Impostare la tensione dell'ago su 4,4 kilovolt positivi.
Coda da uno a 100 rapporto massa-carica e capillare in vetro a 180 gradi celsius. Ispezionare gli spettri risultanti utilizzando il software di analisi per confermare la qualità dei dati. Ora, introdurre 100 microlitri di ogni estratto tramite iniezione diretta alla sorgente di ionizzazione elettrospray, accoppiati allo spettrometro FTICR attraverso una pompa per siringhe impostata su una portata di 3,0 microlitri al minuto.
Impostare i parametri come prima. Regolare il tempo di accumulo degli ioni per ciascun campione o gruppo di campioni in modo da tenere conto della variazione della concentrazione di carbonio. Raccogliere 144 scansioni per ogni campione, eseguire in media le scansioni e quindi eseguire una calibrazione interna utilizzando una serie CH2 omologa.
Essiccare gli estratti usando un concentratore e salvare il resto degli estratti per la successiva spettrometria di massa gascromatografica, spettrometria di massa cromatografica liquida e analisi della spettroscopia di risonanza magnetica nucleare. Per prepararsi a GC-MS, preparare innanzitutto esempi di controllo vuoti come descritto nel protocollo di testo. Per proteggere i gruppi di carbinolo aggiungere 20 microlitri da 30 milligrammi per millilitro metoxamina cloridrato in Paradyne a ciascuno dei campioni, compresi gli estratti di metanolo, gli estratti d'acqua, gli spazi vuoti e i campioni di calibrazione FAME.
Sigillare le fiale con tappi. Vortice gli estratti per 20 secondi, quindi sonicare gli estratti per 60 secondi. Centrifugare gli estratti a 37 gradi celsius per 90 minuti a 100 volte la gravità.
Aggiungere 80 microlitri di MSTFA con 1%trimetilclorosilano a ciascun campione. Dopo aver vortice e sonicato gli estratti come prima, centrifugare nuovamente gli estratti a 37 gradi celsius per 30 minuti a gravità 100 volte. Dopo aver raffreddamento gli estratti a temperatura ambiente, trasferire in flaconcini autocampionatore GC-MS.
Procedere all'analisi GC-MS e all'elaborazione dei dati come descritto nel protocollo di testo. Per prepararsi all'analisi NMR allo stato liquido, diluire il resto degli estratti d'acqua del 10% con uno standard interno DSS da cinque millimolari. Trasferire la miscela in un tubo NMR in vetro borosilicato di alta qualità di tre millimetri di diametro esterno.
Procedere all'analisi NMR e all'elaborazione dei dati come descritto nel protocollo di testo. Per eseguire l'analisi lipidomica LC-MS, iniettare 10 microlitri di ogni estratto in un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni, accoppiato a uno spettrometro di massa Orbitrap utilizzando una colonna ibrida di superficie caricata in fase inversa. Impostare una sfumatura di 34 minuti come elencato nel protocollo di testo con una portata di 250 microlitri al minuto.
Usa sia modalità di ionizzazione negativa che positiva con una maggiore dissociazione da collisione energetica e dissociazione indotta dalla collisione. Per eseguire l'analisi della proteomica, estrarre prima le proteine secondo il protocollo MPLEx per il resto della fase del metanolo come delineato nel protocollo di testo. La torba è stata confrontata con la profondità nella palude S1 presso il sito Spruce and Peatlands Response Under Changing Environments o SPRUCE in Minnesota, USA.
3.312 enzimi sono stati identificati nell'analisi della proteomica. Un'analisi delle attività enzimatiche con profondità rivela che il numero di enzimi diminuisce bruscamente tra i 15 centimetri e i 45 centimetri nella palude di ABETE ROSSO. Per mostrare come i siti possono variare nelle attività metabolite ed enzimatiche, i risultati di SPRUCE sono confrontati con quelli di una palude di Permafrost e Fen nel nord della Svezia.
Complessivamente sono stati identificati 67.040 metaboliti in tutti i campioni di torba SPRUCE dalla combinazione di analisi FTICR-MS, NMR, GC-MS e LC-MS. Qui è mostrata la frazione relativa delle diverse classi chimiche identificate attraverso varie tecniche nelle diverse profondità. Mentre gli amminoacidi e gli zuccheri diminuiscono con la profondità, questo non si osserva per i lipidi.
Convalidando incrociatamente i metaboliti identificati in tutte le analisi sulla base di dati KEGG è stato determinato che i composti identificati sono coinvolti in percorsi metabolici comuni come il ciclo dell'acido tricarrbossilico, la glicolisi e il metabolismo dello zucchero. Nel corso di questa procedura è fondamentale essere consapevoli delle potenziali fonti di contaminazione. A partire dalla raccolta del campione attraverso l'analisi, i campioni non devono entrare in contatto con plastiche ancorate che possono influire negativamente sulla ionizzazione.
Molti dei solventi utilizzati durante la procedura di estrazione sono pericolosi o infiammabili. Indossare sempre DPI appropriati per evitare il contatto con la pelle e gli occhi, nonché per evitare di contaminare i campioni.
