נבגים חיידקיים חיים המציגים אנטיגן או אנזימים הם חלקיקים פעילים מבחינה תפקודית שיכולים לשמש כחיסונים נגד ריר או ביו-קטריטיים. באופן עקרוני, כל חלבון יכול להיות ספיס ביעילות נבגים. טכניקה זו היא פשוטה ואינו דורש כל מניפולציה גנטית.
לכן, אין שחרור של אורגניזמים רקומביננטיים לסביבה מעורב. בנוסף לחיסון ריר לבני אדם ובעלי חיים, נבגים המציגים אנזימים יכולים להיות מפותחים כמו biocatalyzers לשימוש חוזר. התחל על ידי תיוג פעמיים 10 כדי התשיעי B.subtilis פראי סוג נבגים מטוהרים עם שניים-חמישה או 10 מיקרוגרם ריכוזים של דגם RFP ב 200 microliters של חיץ מחייב בתוספת 50 מילימולר נתרן ציטראט במשך שעה אחת ב 25 מעלות צלזיוס על שייקר נדנדה.
בסוף הדגירה, גלולה תערובות מחייב על ידי צנטריפוגה, ולהעביר את supernatants לתוך צינורות חרוט חדשים לניתוח יעילות פיחה הבאים. לאחר מכן, לשטוף את כדורי הנבג פעמיים עם 200 microliters של חיץ מחייב לכל לשטוף, resuspending כדורי ב 100 microliters של חיץ קשירה טרי לאחר לשטוף השני. להפקת חלבון פני השטח, יש להוסיף 50 מיקרוליטרים של כל נגר ספולקט ל-50 מיקרוליטרים של 2X נתרן דודציל סולפט-דיתיותריתול כדי לבודד את חלבוני הנבגים על פני השטח.
לאחר 45 דקות ב 65 מעלות צלזיוס, לאסוף את תערובות על ידי צנטריפוגה, ולהפעיל 10 microliters של כל נפח של חלבונים שחולצו על טבעי על כתם מערבי, באמצעות נוגדן חד שבטי אנטי שלו מזהה את התג שלו נוכח N-terminus של mRFP כדי לזהות את החלבונים משטח שכותרתו. כדי לאתר ולכומת את המולקולות הסחוטות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, הוסף חמישה מיקרוליטרים של הנגר המפושט ל-95 מיקרוליטרים של PBS, והוסף חמישה מיקרוליטרים של כל מתלה שנוצר על מגלשות מיקרוסקופ בודדות. מניחים כיסוי פולי-L-לינזין מטופל על כל שקופית, ומ מניחים שקופית אחת על שלב מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
לאחר מכן, עבור כל שדה, שמור את תמונות המיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה ופילואורסצנטיות. לניתוח תמונה, פתחו את תמונות המיקרוסקופיה הפלואורסצנטיות ב-ImageJ ובחרו 'תמונה' ו'כתב' כדי לאשר שכל התמונות הן בתבנית של שמונה סיביות. מתפריט 'ניתוח', בחרו 'קבע מידות' ואשרו שנבחרו 'אזור', 'דחיסות משולבת' ו'ערך אפור ממוצע'.
השתמש בכלי ציור או בחירה כדי לצייר קו סביב הנבג של עניין, ובחר למדוד מתפריט ניתוח. תופיע תיבה מוקפצת עם ערימת ערכים עבור הנבג שנבחר. לאחר שנבחרו לפחות 50 נבגים, בחר מספר אזורים ללא נבגים וחזור על המדידה כדי לקבל קריאה עבור פלואורסצנטיות הרקע.
לאחר קבלת מספר מדידות רקע, העתק את כל הנתונים בחלון התוצאות לגיליון אלקטרוני וחשב את ממוצע הצפיפות המשולבת באזור הנבגים שנבחרו ואת ערכי הפלואורסצנטיות ברקע כדי לקבל את הפלואורסצנטיות הכוללת לכל תא מתוקן. להערכת יעילות פיח עקיפה, בצעו שישה דילולים סדרתיים כפולים של mRFP מטוהר בריכוז של 0.5 ננוגרם למיקרוליטר לנפח סופי של 250 מיקרוליטרים לדילול מחייב חיץ ומספר ניסיוני מתאים של דילול טורי כפול של 100 מיקרוליטרים של כל מדגם על-טבעי שמור המכיל את שבר ה- mRFP הלא מאוגד של תגובת הפילחות עם 100 מיקרוליטרים של מאגר כריכה לדילול. לאחר מכן, לחתוך קרום nitrocellulose עם ניתוק 0.45 מיקרומטר לגודל של תשעה על 10 ס"מ, כדי לכסות את חמש מדגם על שש נקודות של דילול שטח מבלי להרחיב מעבר לקצה אטם של מנגנון כתם נקודה.
מניחים את קרום prewet ב מכשיר כתם נקודה. בדוק את הגודל הנכון של הממברנה, ולהסיר את כל בועות האוויר לכודים בין הממברנה ואת אטם. להרכיב את מנגנון כתם נקודה כפי שתואר על ידי היצרן, ולכסות את החלק שאינם שימוש של המנגנון כדי למנוע אוויר לנוע דרך בארות אלה.
כאשר המנגנון מוכן, לטעון את התקן בשני הנתיבים החיצוניים ביותר ואת הדגימות בנתיבים האמצעיים עם 100 microliters של כל דילול מתאים לכל באר. לאחר שכל הדגימות נטענו, הפעל את משאבת הוואקום במשך שתי דקות, לפני עצירת הוואקום ואיפשר לדגימות לסנן דרך הממברנה בכוח הכבידה. לאחר 10 דקות, לשטוף כל באר עם 100 microliters של PBS.
תריץ את משאבת הוואקום לחמש דקות נוספות. כאשר מאגר הכביסה התנקז לחלוטין מהמוקטר, בעוד הוואקום דול, שחרר את הברגים ופתח בזהירות את מנגנון כתם הנקודות. לאחר מכן, לעבד את הממברנה על פי פרוטוקולים כתם מערבי סטנדרטי.
לניתוח דנסיטומטרי של המסנן, פתחו את ImageJ ושרטטו כל נקודה כדי למדוד את הצפיפות המשולבת באמצעות הפקודה 'נתח', 'מדידה' כפי שהוכח. כדי לבצע תיקון רקע של התמונה, צייר עיגול באזור ריק ולמדוד את הצפיפות המשולבת שלו כפי שהוכח. לתאם את הצפיפות המשולבת של הנקודות הסטנדרטיות עם כמות החלבון הטעון כדי להשיג קו כיול, ולהשתמש בעקומת הכיול כדי לשער את ריכוז ה- mRFP של כל נקודה לדוגמה.
לאחר מכן ניתן לחשב את ריכוז ה- mRFP שנותר בשברים הלא מאוגדים. נוכחותם של חלבונים בגודל הצפוי רק בנתיבים עמוסים בתמצית של הנבגים המפולסים מעידה על תגובת ספיחים מוצלחת. הערכה ישירה של יעילות הספגוע תלויה בחלבון ההטרולוגי ששימש ונוכל להתבצע על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וציקטופלורימטריה של שבר גלולה לאחר השבר של תגובת הספח.
לכמת את אותות הפלואורסצנט הקיימים על נבגים ניתן לבצע באמצעות ImageJ כפי שהוכח. ניתוח עקיף של יעילות ספיגת יכול להתבצע על ידי ניתוח כתמי נקודה של השבר העל-טבעי המכיל את החלבון הלא מאוגד, וניתוח צפיפות עוקב של החלבון הלא מאוגד מאפשר חישוב עקיף של כמות החלבון ששופך על הנבגים. אמנם, באופן עקרוני, כל חלבון יכול להיות סחוף לשימוש כמו חיסונים ריר או biocatalysts, בפועל את היעילות של סחוף תלוי באתרי החלבון ואת המאפיינים הכימיים.
