Esporos bacterianos vivos que exibem antígeno ou enzimas são nanopartículas funcionalmente ativas que podem ser usadas como vacinas mucosas ou biocatalissas. Em princípio, qualquer proteína pode ser eficientemente adsorvida aos esporos. Esta técnica é simples e não requer manipulação genética.
Portanto, não há liberação de organismos recombinantes no ambiente. Além da vacinação mucosa para humanos e animais, esporos que exibem enzimas podem ser desenvolvidos como biocatalyzers reutilizáveis. Comece rotulando duas vezes 10 a nona B.subtilis esporos purificados do tipo selvagem com concentrações de dois ou cinco ou 10 microgramas do modelo RFP em 200 microliters de tampão de ligação complementado com 50 milimolares de sódio citrato por uma hora a 25 graus Celsius em um shaker de balanço.
No final da incubação, pelota as misturas de ligação por centrifugação, e transfira os supernantes em novos tubos cônicos para análise subsequente de eficiência de adsorção. Em seguida, lave as pelotas de esporo duas vezes com 200 microliters de tampão de ligação por lavagem, reutilizando as pelotas em 100 microliters de tampão de ligação fresco após a segunda lavagem. Para extração de proteína superficial, adicione 50 microliters de cada resuspensão de esporos adsorvida a 50 microlitres de sulfato de sódio 2X de sódio dodecyl-dithiothiothreitol para solubilizar as proteínas de esporos superficiais.
Após 45 minutos a 65 graus Celsius, colete as misturas por centrifugação, e execute 10 microliters de cada volume de proteínas extraídas sobrenascer em uma mancha ocidental, usando um anticorpo monoclonal anti-Seu reconhecendo a sua marca presente no N-terminus de mRFP para identificar as proteínas superficiais rotuladas. Para localizar e quantificar as moléculas adsorvidas por microscopia de fluorescência, adicione cinco microlitros da ressuspensão de esporos adsorvida a 95 microlitros de PBS, e adicione cinco microlitros de cada suspensão resultante em slides de microscópio individuais. Coloque uma mancha de cobertura tratada com poli-L-lisina em cada slide e coloque um slide em um estágio de microscópio de fluorescência.
Em seguida, para cada campo, salve as imagens de microscopia de contraste de fase e fluorescência. Para análise de imagem, abra as imagens de microscopia de fluorescência no ImageJ e selecione Imagem e Tipo para confirmar se todas as imagens estão em formato de oito bits. No menu Analisar, selecione Definir medidas e confirme se a área, a densidade integrada e o valor cinza médio são selecionados.
Use uma ferramenta de desenho ou seleção para desenhar uma linha em torno do esporo de interesse e selecione Medir no menu Analisar. Uma caixa pop-up com uma pilha de valores para o esporo selecionado aparecerá. Após a leção de pelo menos 50 esporos, selecione várias regiões sem esporos e repita a medição para obter uma leitura para a fluorescência de fundo.
Após obter várias medições de fundo, copie todos os dados na janela Resultados em uma planilha e calcule a média da densidade integrada na área dos esporos selecionados e os valores de fluorescência de fundo para obter a fluorescência total por célula corrigida. Para avaliação indireta da eficiência da adsorção, execute seis diluições seriais duas vezes de mRFP purificada a uma concentração de 0,5 nanograma por microliter a um volume final de 250 microliters por diluição no buffer de ligação e um número experimental apropriado de diluições seriais duas vezes de 100 microlitres de cada amostra supernante reservada contendo a fração mRFP desvinculada da reação de adsorção com 100 microliters de buffer de ligação por diluição. Em seguida, corte uma membrana de nitrocelulose com um corte de 0,45 micrômetros para um tamanho de nove por 10 centímetros, para cobrir uma área de cinco amostras por seis pontos de diluição sem estender-se além da borda da junta do aparelho de manchas de ponto.
Coloque a membrana prewet no aparelho de mancha de ponto. Verifique o tamanho correto da membrana e remova quaisquer bolhas de ar presas entre a membrana e a junta. Monte o aparelho de mancha de ponto, conforme descrito pelo fabricante, e cubra a parte não utilizada do aparelho para evitar que o ar se mova através desses poços.
Quando o aparelho estiver pronto, carregue o padrão nas duas faixas mais externas e as amostras nas faixas do meio com 100 microliters de cada diluição apropriada por poço. Quando todas as amostras tiverem sido carregadas, ligue a bomba de vácuo por dois minutos, antes de parar o vácuo e permitir que as amostras se filtrem através da membrana por gravidade. Após 10 minutos, lave cada poço com 100 microliters de PBS.
Execute a bomba de vácuo por mais cinco minutos. Quando o tampão de lavagem tiver sido completamente drenado do aparelho, enquanto o vácuo estiver ligado, solte os parafusos e abra cuidadosamente o aparelho de mancha de ponto. Então, processe a membrana de acordo com os protocolos padrão de manchas ocidentais.
Para análise densitométrica do filtro, abra ImageJ e delineie cada ponto para medir a densidade integrada usando o comando Analisar, medir conforme demonstrado. Para fazer uma correção de fundo da imagem, desenhe um círculo em uma área vazia e meça sua densidade integrada como demonstrado. Correlacionar a densidade integrada dos pontos padrão com a quantidade de proteína carregada para obter uma linha de calibração, e usar a curva de calibração para extrapolar a concentração de mRFP de cada ponto amostral.
A concentração do mRFP remanescente nas frações não ligadas pode então ser calculada. A presença de proteínas do tamanho esperado apenas nas pistas carregadas com um extrato dos esporos adsorvidos é indicativo de uma reação de adsorção bem sucedida. A avaliação direta da eficiência da adsorção depende da proteína heteróloga que tem sido utilizada e pode ser realizada por microscopia de fluorescência e citofluormetria da fração de pelotas após o fracionamento da reação de adsorção.
A quantificação dos sinais fluorescentes presentes nos esporos pode então ser realizada usando ImageJ como demonstrado. Uma análise indireta da eficiência de adsorção pode ser realizada por uma análise de manchas de pontos da fração sobrenante contendo a proteína não ligada, e a análise densitométrica subsequente da proteína não ligada permite o cálculo indireto da quantidade de proteína adsorvida nos esporos. Embora, em princípio, qualquer proteína possa ser adsorvida para uso como vacinas mucosas ou biocatalísticos, na prática a eficiência da adsorção depende dos locais proteicos e propriedades químicas.
