Lebende bakterielle Sporen mit Antigen oder Enzymen sind funktionell aktive Nanopartikel, die als Schleimhautimpfstoffe oder Biokatalysatoren verwendet werden können. Grundsätzlich kann jedes Protein effizient auf Sporen adsorbiert werden. Diese Technik ist einfach und erfordert keine genetische Manipulation.
Daher ist keine Freisetzung rekombinanter Organismen in die Umwelt beteiligt. Neben der Schleimhautimpfung für Mensch und Tier können Sporen mit Enzymen als wiederverwendbare Biokatalysatoren entwickelt werden. Beginnen Sie mit der Kennzeichnung von zwei mal 10 bis zum neunten B.subtilis Wildtyp gereinigten Sporen mit zwei-fünf- oder 10-Mikrogramm-Konzentrationen des Modells RFP in 200 Mikroliter Bindungspuffer, ergänzt mit 50-Millimolar-Natriumcitrat für eine Stunde bei 25 Grad Celsius auf einem Schaukelschüttler.
Am Ende der Inkubation die Bindungsmischungen durch Zentrifugation pellet und die Überräube in neue konische Rohre für die anschließende Adsorptionseffizienzanalyse übertragen. Dann die Sporenpellets zweimal mit 200 Mikroliter Bindungspuffer pro Wäsche waschen und die Pellets nach der zweiten Wäsche in 100 Mikroliter frischer Bindungspuffer wieder aufhängen. Für die Oberflächenproteinextraktion 50 Mikroliter jeder adsorbierten Sporenresuspension zu 50 Mikrolitern 2X Natriumdodecylsulfat-Dithiothreitol hinzufügen, um die Oberflächensporenproteine zu saugen.
Nach 45 Minuten bei 65 Grad Celsius, sammeln Sie die Mischungen durch Zentrifugation, und laufen 10 Mikroliter jedes Volumens von extrahierten Proteinen übereinem westlichen Fleck, wobei ein monoklonaler Anti-His-Antikörper den His-Tag erkennt, der am N-Terminus von mRFP vorhanden ist, um die markierten Oberflächenproteine zu identifizieren. Um die adsorbierten Moleküle durch Fluoreszenzmikroskopie zu lokalisieren und zu quantifizieren, fügen Sie fünf Mikroliter der adsorbierten Sporenresuspension zu 95 Mikroliter PBS hinzu und fügen Sie fünf Mikroliter jeder resultierenden Suspension auf einzelne Mikroskopschlitten hinzu. Legen Sie einen mit Poly-L-Lysin behandelten Deckelauf auf jedes Dia und legen Sie ein Dia auf eine Fluoreszenzmikroskopstufe.
Speichern Sie dann für jedes Feld die Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopiebilder. Öffnen Sie für die Bildanalyse die Fluoreszenzmikroskopiebilder in ImageJ, und wählen Sie Bild und Typ aus, um zu bestätigen, dass alle Bilder im Acht-Bit-Format vorliegen. Wählen Sie im Menü Analysieren die Option Messungen festlegen aus, und bestätigen Sie, dass Fläche, integrierte Dichte und mittlerer Grauwert ausgewählt sind.
Verwenden Sie ein Zeichnungs- oder Auswahlwerkzeug, um eine Linie um den Interessenssporen zu zeichnen, und wählen Sie Im Menü Analysieren die Option Messen aus. Es wird ein Popupfeld mit einem Stapel von Werten für die ausgewählte Sporen angezeigt. Nachdem mindestens 50 Sporen ausgewählt wurden, wählen Sie mehrere Regionen ohne Sporen aus, und wiederholen Sie die Messung, um einen Messwert für die Hintergrundfluoreszenz zu erhalten.
Nachdem Sie mehrere Hintergrundmessungen erhalten haben, kopieren Sie alle Daten im Ergebnisfenster in eine Kalkulationstabelle, und berechnen Sie den Mittelwert der integrierten Dichte im Bereich der ausgewählten Sporen und die Hintergrundfluoreszenzwerte, um die korrigierte Gesamtfluoreszenz pro Zelle zu erhalten. Für die indirekte Adsorptionseffizienzbewertung Sechs zweifache serielle Verdünnungen von gereinigtem mRFP bei einer Konzentration von 0,5 Nanogramm pro Mikroliter auf ein Endvolumen von 250 Mikrolitern pro Verdünnung im Bindungspuffer und eine entsprechende experimentelle Anzahl von zweifachen seriellen Verdünnungen von 100 Mikrolitern jeder reservierten Überstandprobe, die den ungebundenen mRFP-Anteil der Adsorptionsreaktion mit 100 Mikrolitern bindungspuffern. Als nächstes schneiden Sie eine Nitrocellulosemembran mit einem 0,45-Mikrometer-Cutoff auf eine Größe von neun mal zehn Zentimetern, um einen Fünf-Mal-mit-sechs-Punkte-der-Verdünnungsbereich abzudecken, ohne sich über den Rand der Dichtung des Punktfleckapparats hinaus auszudehnen.
Legen Sie die vornasse Membran in das Punktblot-Gerät. Überprüfen Sie die richtige Größe der Membran, und entfernen Sie alle Luftblasen, die zwischen der Membran und der Dichtung eingeschlossen sind. Montieren Sie das Vom Hersteller beschriebene Punktblot-Gerät und decken Sie den unbenutzten Teil des Geräts ab, um zu verhindern, dass sich Luft durch diese Brunnen bewegt.
Wenn das Gerät fertig ist, laden Sie die Norm in den beiden äußeren Bahnen und die Proben in den mittleren Bahnen mit 100 Mikroliter jeder geeigneten Verdünnung pro Brunnen. Wenn alle Proben geladen sind, schalten Sie die Vakuumpumpe für zwei Minuten ein, bevor Sie das Vakuum anhalten und die Proben durch die Membran durch die Schwerkraft filtern können. Nach 10 Minuten jeden Brunnen mit 100 Mikroliter PBS waschen.
Führen Sie die Vakuumpumpe weitere fünf Minuten aus. Wenn der Waschpuffer vollständig aus dem Gerät abgelassen ist, während das Vakuum eingeschaltet ist, lösen Sie die Schrauben und öffnen Sie vorsichtig das Punktblot-Gerät. Verarbeiten Sie dann die Membran nach den üblichen Western Blot-Protokollen.
Öffnen Sie für die densitometrische Analyse des Filters ImageJ, und skizzieren Sie jeden Punkt, um die integrierte Dichte mithilfe des Befehls Analysieren, Messen zu messen, wie gezeigt. Um eine Hintergrundkorrektur des Bildes vorzunehmen, zeichnen Sie einen Kreis in einem leeren Bereich, und messen Sie seine integrierte Dichte, wie gezeigt. Korrelieren Sie die integrierte Dichte der Standardpunkte mit der Menge des geladenen Proteins, um eine Kalibrierlinie zu erhalten, und verwenden Sie die Kalibrierkurve, um die Konzentration von mRFP jedes Probenpunkts zu extrapolieren.
Die Konzentration des in den ungebundenen Fraktionen verbleibenden mRFP kann dann berechnet werden. Das Vorhandensein von Proteinen der erwarteten Größe nur in den Bahnen, die mit einem Extrakt der adsorbierten Sporen beladen sind, ist ein Indiz für eine erfolgreiche Adsorptionsreaktion. Die direkte Bewertung der Adsorptionseffizienz hängt vom verwendeten heterologen Protein ab und kann durch Fluoreszenzmikroskopie und Zytofluorimemetrie der Pelletfraktion nach der Fraktionierung der Adsorptionsreaktion durchgeführt werden.
Die Quantifizierung der auf Sporen vorhandenen Fluoreszenzsignale kann dann mit ImageJ durchgeführt werden, wie gezeigt. Eine indirekte Analyse der Adsorptionseffizienz kann durch eine Punktblotting-Analyse der Überstandfraktion durchgeführt werden, die das ungebundene Protein enthält, und eine nachfolgende densitometrische Analyse des ungebundenen Proteins ermöglicht die indirekte Berechnung der Menge des auf die Sporen adsorbierten Proteins. Obwohl grundsätzlich jedes Protein für die Verwendung als Schleimhautimpfstoffe oder Biokatalysatoren adsorbiert werden kann, hängt die Wirksamkeit der Adsorption in der Praxis von den Proteinstandorten und den chemischen Eigenschaften ab.
