항원 또는 효소를 표시하는 살아있는 세균성 포자는 점막 백신 또는 생물 촉매로 사용될 수 있는 기능적으로 활성 나노입자입니다. 원칙적으로 모든 단백질은 포자에 효율적으로 흡착될 수 있습니다. 이 기술은 간단하고 어떤 유전 조작을 필요로하지 않습니다.
따라서 재조합 유기체가 환경에 방출되지 않는다. 인간과 동물을 위한 점막 백신학 이외에, 효소를 표시하는 포자는 재사용 가능한 biocatalyzers로 개발될 수 있습니다. 먼저 10~9회 B.subtilis 야생식 정제 포자를 2-5 또는 10마이크로그램의 모델 RFP 농도로 200마이크로리터의 결합 완충제20마이크로리터에 흔들 셰이커에서 섭씨 25도에서 1시간 동안 보충합니다.
인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의한 결합 혼합물을 펠렛하고, 후속 흡착 효율 분석을 위해 새로운 원판 튜브로 슈퍼네이션을 전송한다. 이어서, 포자 펠릿을 세척당 200 마이크로리터의 결합 버퍼로 두 번 세척하고, 두 번째 세척 후 신선한 결합 버퍼100 마이크로리터로 펠릿을 재연한다. 표면 단백질 추출의 경우, 각 흡착 포자 리서스펜션 50마이크로리터를 2X 나트륨 도데실 황산염-디티오트리톨 50마이크로리터에 추가하여 표면 포자 단백질을 용해시합니다.
섭씨 65도에서 45분 후, 원심분리에 의한 혼합물을 수집하고, 서쪽 블롯에 추출된 단백질의 각 부피의 10마이크로리터를 실행하여, 단클론 항-그의 항체를 사용하여 mRFP의 N 단부에서 존재하는 그의 태그를 인식하여 표지된 표면 단백질을 식별한다. 형광 현미경 검사법에 의해 흡착 된 분자를 국소화하고 정량화하려면 흡착 된 포자 재서스펜션 5 개를 PBS의 95 마이크로 리터에 추가하고 각 결과 현탁액5 마이크로 리터를 개별 현미경 슬라이드에 추가합니다. 폴리 L-리신 처리 커버슬립을 각 슬라이드에 놓고 한 슬라이드를 형광 현미경 단계에 놓습니다.
그런 다음 각 필드에 대해 위상 대비 및 형광 현미경 이미지를 저장합니다. 이미지 분석을 위해 ImageJ에서 형광 현미경 이미지를 열고 이미지 및 유형을 선택하여 모든 이미지가 8비트 형식으로 되어 있는지 확인합니다. 분석 메뉴에서 측정 설정을 선택하고 영역, 통합 밀도 및 평균 회색 값이 선택되어 있는지 확인합니다.
도면 또는 선택 도구를 사용하여 관심 있는 포자 주위에 선을 그리고 분석 메뉴에서 측정을 선택합니다. 선택한 포자에 대한 값 스택이 있는 팝업 상자가 나타납니다. 적어도 50개의 포자가 선택된 후, 포자 없이 여러 영역을 선택하고, 측정을 반복하여 배경 형광에 대한 판독값을 얻습니다.
여러 배경 측정을 얻은 후 결과 창내의 모든 데이터를 스프레드시트에 복사하고 선택한 포자 및 배경 형광 값영역에서 통합 밀도의 평균을 계산하여 수정된 셀당 형광을 얻습니다. 간접 흡착 효율 평가를 위해, 결합 버퍼에서 희석당 250 마이크로리터의 최종 부피와 각 예약 된 미신탄 시료 100 마이크로리터의 적절한 실험 수에 대한 0.5 나노그램 당 마이크로리터 농도에서 정제 된 mRFP의 6 배 연속 희석을 수행 하여 10 개의 미바운드 mRFP 분획을 포함하는 각 예약 된 미신 탄성 샘플의 100 마이크로 리터의 적절한 실험 적 수10 마이크로리터. 다음으로, 0.45 마이크로미터 컷오프로 니트로셀룰로오스 멤브레인을 9-10센티미터 크기로 자르고, 도트 블롯 장치의 개스킷 가장자리를 넘어 연장하지 않고 5개의 시료-6점 희석 영역을 덮는다.
도트 블롯 장치에 전습 멤브레인을 배치합니다. 멤브레인의 정확한 크기를 확인하고 멤브레인과 개스킷 사이에 갇힌 기포를 제거하십시오. 제조업체에 의해 설명된 바와 같이 도트 블롯 장치를 조립하고, 공기가 그 우물을 통해 이동하는 것을 방지하기 위해 장치의 미사용 부분을 커버한다.
장치가 준비되면, 두 개의 가장 외부 차선과 중간 차선의 샘플을 잘 당 각각의 100 마이크로리터로 적재한다. 모든 시료가 적재되면 진공 펌프를 2분 동안 켜고 진공을 멈추고 시료가 중력에 의해 멤브레인을 통과할 수 있도록 합니다. 10분 후, PBS 100마이크로리터로 각 웰을 씻으시면 됩니다.
진공 펌프를 5분간 더 실행합니다. 세척 버퍼가 장치에서 완전히 배수되면 진공이 켜져있는 동안 나사를 느슨하게하고 조심스럽게 도트 블롯 장치를 엽니 다. 그런 다음 표준 서부 블롯 프로토콜에 따라 멤브레인을 처리합니다.
필터의 밀도 측정 해석의 경우 ImageJ를 열고 각 점을 윤곽을 잡아 분석, 측정 명령을 사용하여 통합 밀도를 측정합니다. 이미지를 배경 보정하려면 빈 영역에 원을 그리고 설명한 대로 통합 밀도를 측정합니다. 표준 도트의 통합 밀도를 적재된 단백질의 양과 상관관계를 맺고 교정 곡선을 사용하여 각 샘플 점의 mRFP 농도를 추정한다.
그런 다음 언바운드 분획에 남아있는 mRFP의 농도를 계산할 수 있습니다. 흡착 포자의 추출물이 적재된 차선에서만 예상되는 크기의 단백질의 존재는 성공적인 흡착 반응을 나타낸다. 흡착 효율의 직접적인 평가는 사용되어 온 이종 단백질에 따라 달라지며 흡착 반응의 분획 후 펠릿 분획의 형광 현미경 검사법과 세포성불피계에 의해 수행될 수 있다.
포자에 존재하는 형광 신호의 정량화는 시연된 대로 ImageJ를 사용하여 수행될 수 있다. 흡착 효율의 간접분석은 언바운드 단백질을 함유하는 미상부 분획의 도트 블로팅 분석에 의해 수행될 수 있으며, 결합되지 않은 단백질의 후속 밀도 측정 분석을 통해 포자에 흡착된 단백질의 양을 간접적으로 계산할 수 있다. 비록, 원칙적으로, 어떤 단백질은 점막 백신 또는 생물 촉매로 사용하기 위해 흡착 될 수 있지만, 실제로 흡착의 효율성은 단백질 사이트 및 화학 적 특성에 따라 달라집니다.
