Le spore batteriche vive che mostrano antigene o enzimi sono nanoparticelle funzionalmente attive che possono essere utilizzate come vaccini mucosi o biocatalizzatori. In linea di principio, qualsiasi proteina può essere assorbita in modo efficiente alle spore. Questa tecnica è semplice e non richiede alcuna manipolazione genetica.
Pertanto, non è coinvolto alcun rilascio di organismi ricombinanti nell'ambiente. Oltre alla vaccinologia della mucosa per l'uomo e gli animali, le spore che mostrano enzimi possono essere sviluppate come biocatalizzatori riutilizzabili. Inizia etichettando due volte 10 alla nona B.subtilis spore purificate di tipo selvatico con concentrazioni di due-cinque o 10 microgrammi del modello RFP in 200 microlitri di tampone legante integrati con citrato di sodio 50 millimolare per un'ora a 25 gradi Celsius su uno shaker a dondolo.
Al termine dell'incubazione, pellettare le miscele di legame per centrifugazione e trasferire i supernaganti in nuovi tubi conici per la successiva analisi dell'efficienza di adsorbimento. Quindi, lavare i pellet di spore due volte con 200 microlitri di tampone legante per lavaggio, rimescolando i pellet in 100 microlitri di tampone di legame fresco dopo il secondo lavaggio. Per l'estrazione di proteine superficiali, aggiungere 50 microlitri di ogni ressorbimento delle spore adsorbite a 50 microlitri di dodecil solfato di sodio-ditiothiothreitol per solubilizzare le proteine delle spore superficiali.
Dopo 45 minuti a 65 gradi Celsius, raccogliere le miscele per centrifugazione ed eseguire 10 microlitri di ogni volume di proteine estratte supernatanti su una macchia occidentale, usando un anticorpo monoclonale anti-His riconoscendo il Suo tag presente all'N-terminale di mRFP per identificare le proteine superficiali etichettate. Per localizzare e quantificare le molecole adsorbite mediante microscopia a fluorescenza, aggiungere cinque microlitri della ressorbimento della spora adsorbita a 95 microlitri di PBS e aggiungere cinque microlitri di ogni sospensione risultante su singoli vetrini del microscopio. Posizionare una coverslip trattata con poli-L-lisina su ogni diapositiva e posizionare uno scivolo su uno stadio di microscopio a fluorescenza.
Quindi, per ogni campo, salvare le immagini di microscopia a contrasto di fase e fluorescenza. Per l'analisi delle immagini, aprite le immagini della microscopia a fluorescenza in ImageJ e selezionate Immagine e Tipo (Image) e Tipo (Type) per confermare che tutte le immagini sono in formato a otto bit. Scegliere Imposta misure dal menu Analizza e verificare che siano selezionati Area, Densità integrata e Valore grigio medio.
Utilizzate uno strumento di disegno o selezione per tracciare una linea attorno alla spora di interesse e selezionate Misura (Measure) dal menu Analizza (Analyze). Verrà visualizzata una casella popup con una pila di valori per la spora selezionata. Dopo aver selezionato almeno 50 spore, selezionare diverse regioni senza spore e ripetere la misurazione per ottenere una lettura per la fluorescenza di fondo.
Dopo aver ottenuto diverse misurazioni in background, copiare tutti i dati nella finestra Risultati in un foglio di calcolo e calcolare la media della densità integrata nell'area delle spore selezionate e i valori di fluorescenza di fondo per ottenere la fluorescenza totale per cella corretta. Per la valutazione indiretta dell'efficienza di adsorbimento, eseguire sei diluizioni seriali due volte di mRFP purificato a una concentrazione di 0,5 nanogrammi per microlitri a un volume finale di 250 microlitri per diluizione nel buffer di legame e un numero sperimentale appropriato di diluizioni seriali due volte di 100 microlitri di ciascun campione supernatante riservato contenente la frazione mRFP non vincolata della reazione di adsorbimento con 100 microlitri di tampone di legame per diluizione. Successivamente, tagliare una membrana di nitrocellulosa con un taglio di 0,45 micrometri a una dimensione di nove per 10 centimetri, per coprire un'area di diluizione di cinque campioni per sei punti senza estendersi oltre il bordo della guarnizione dell'apparato a macchie di punti.
Posizionare la membrana del prewet nell'apparato a macchie a punti. Controllare le dimensioni corrette della membrana e rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate tra la membrana e la guarnizione. Assemblare l'apparato a macchie di punti come descritto dal produttore e coprire la parte inutilizzata dell'apparecchio per evitare che l'aria si muova attraverso quei pozzi.
Quando l'apparecchio è pronto, caricare lo standard nelle due corsie più esterne e i campioni nelle corsie centrali con 100 microlitri di ogni diluizione appropriata per pozzo. Una volta caricati tutti i campioni, accendere la pompa del vuoto per due minuti, prima di arrestare il vuoto e consentire ai campioni di filtrare attraverso la membrana per gravità. Dopo 10 minuti, lavare ogni bene con 100 microlitri di PBS.
Eseguire la pompa per vuoto per altri cinque minuti. Quando il tampone di lavaggio si è completamente scaricato dall'apparecchio, mentre il vuoto è aperto, allentare le viti e aprire con cura l'apparato a macchie di punti. Quindi, elaborare la membrana secondo i protocolli western blot standard.
Per l'analisi densitometrica del filtro, aprire ImageJ e delineare ogni punto per misurare la densità integrata utilizzando il comando Analizza, misura come illustrato. Per apportare una correzione di sfondo all'immagine, disegnare un cerchio in un'area vuota e misurarne la densità integrata come dimostrato. Correlare la densità integrata dei punti standard con la quantità di proteine caricate per ottenere una linea di calibrazione e utilizzare la curva di calibrazione per estrapolare la concentrazione di mRFP di ogni punto campione.
È quindi possibile calcolare la concentrazione dell'mRFP rimanente nelle frazioni non vincolate. La presenza di proteine della dimensione prevista solo nelle corsie caricate con un estratto delle spore adsorbite è indicativa di una reazione di adsorbimento riuscita. La valutazione diretta dell'efficienza di adsorbimento dipende dalla proteina eterologa che è stata utilizzata e può essere eseguita mediante microscopia a fluorescenza e citofluorimetria della frazione pellet dopo il frazionamento della reazione di adsorbimento.
La quantificazione dei segnali fluorescenti presenti sulle spore può quindi essere eseguita utilizzando ImageJ come dimostrato. Un'analisi indiretta dell'efficienza di adsorbimento può essere eseguita da un'analisi dot blotting della frazione supernatante contenente la proteina non vincolata, e la successiva analisi densitometrica della proteina non vincolata consente il calcolo indiretto della quantità di proteina adsorbita sulle spore. Sebbene, in linea di principio, qualsiasi proteina possa essere adsorbita per l'uso come vaccini mucosi o biocatalografi, in pratica l'efficienza dell'adsorbimento dipende dai siti proteici e dalle proprietà chimiche.
