Les spores bactériennes vivantes présentant des antigènes ou des enzymes sont des nanoparticules fonctionnellement actives qui peuvent être utilisées comme vaccins muqueux ou biocatalyseurs. En principe, n’importe quelle protéine peut être efficacement adsorbée aux spores. Cette technique est simple et ne nécessite aucune manipulation génétique.
Par conséquent, aucun rejet d’organismes recombinants dans l’environnement n’est en cause. En plus de la vaccinologie muqueuse pour les humains et les animaux, les spores présentant des enzymes peuvent être développées sous forme de biocatalyseurs réutilisables. Commencez par étiqueter deux fois 10 à la neuvième spores purifiées de type sauvage B.subtilis avec des concentrations de deux concentrations de cinq ou dix microgrammes de DP modèle dans 200 microlitres de tampon liant complétés par du citrate de sodium de 50 millimolaires pendant une heure à 25 degrés Celsius sur un shaker berçant.
À la fin de l’incubation, pelleter les mélanges de liaison par centrifugation, et transférer les supernatants dans de nouveaux tubes coniques pour une analyse ultérieure de l’efficacité de l’adsorption. Ensuite, lavez les granulés de spores deux fois avec 200 microlitres de tampon liant par lavage, en réutilisant les granulés dans 100 microlitres de tampon de liaison fraîche après le deuxième lavage. Pour l’extraction des protéines de surface, ajouter 50 microlitres de chaque résuspension adsorbed spore à 50 microlitres de 2X sodium dodecyl sulfate-dithiothreitol pour solubiliser les protéines spore de surface.
Après 45 minutes à 65 degrés Celsius, recueillir les mélanges par centrifugation, et exécuter 10 microlitres de chaque volume de protéines extraites supernatant sur une tache occidentale, à l’aide d’un anticorps monoclonal reconnaissant l’étiquette Son présent au N-terminus de mRFP pour identifier les protéines de surface étiquetées. Pour localisé et quantifier les molécules adsorbed par microscopie de fluorescence, ajoutez cinq microlitres de la résuspension adsorbed de spore à 95 microlitres de PBS, et ajoutez cinq microlitres de chaque suspension résultante sur les glissières individuelles de microscope. Placez un couvercle traité à la poly-L-lysine sur chaque diapositive et placez une diapositive sur un stade de microscope à fluorescence.
Ensuite, pour chaque champ, enregistrer les images de microscopie de contraste de phase et de fluorescence. Pour l’analyse d’images, ouvrez les images de microscopie de fluorescence dans ImageJ, et sélectionnez Image et Type pour confirmer que toutes les images sont en format huit bits. À partir du menu Analyser, sélectionnez Mesures définies et confirmez que la zone, la densité intégrée et la valeur grise moyenne sont sélectionnées.
Utilisez un outil de dessin ou de sélection pour tracer une ligne autour de la spore d’intérêt et sélectionnez Mesurer dans le menu Analyser. Une boîte popup avec une pile de valeurs pour la spore sélectionnée apparaîtra. Après qu’au moins 50 spores ont été sélectionnées, sélectionnez plusieurs régions sans spores, et répétez la mesure pour obtenir une lecture pour la fluorescence de fond.
Après avoir obtenu plusieurs mesures de fond, copiez toutes les données de la fenêtre Résultats dans une feuille de calcul et calculez la moyenne de la densité intégrée dans la zone des spores sélectionnées et les valeurs de fluorescence de fond pour obtenir la fluorescence totale par cellule corrigée. Pour l’évaluation indirecte de l’efficacité de l’adsorption, effectuer six dilutions en série doubles de mRFP purifié à une concentration de 0,5 nanogramme par microlitre à un volume final de 250 microlitres par dilution dans le tampon contraignant et un nombre expérimental approprié de dilutions en série doubles de 100 microlitres de chaque échantillon réservé de supernatant contenant la fraction non lié de mRFP de la réaction d’adsorption avec 100 microlitres de tampon liant par dilution. Ensuite, coupez une membrane de nitrocellulose avec une coupure de 0,45 micromètre à une taille de neuf par 10 centimètres, pour couvrir une zone de dilution de cinq échantillons par six points sans s’étendre au-delà du bord du joint de l’appareil de tache à points.
Placez la membrane préwet dans l’appareil de tache de point. Vérifiez la taille correcte de la membrane et enlevez les bulles d’air emprisonnées entre la membrane et le joint. Assemblez l’appareil à taches à points tel que décrit par le fabricant et couvrez la partie inutilisée de l’appareil pour empêcher l’air de se déplacer à travers ces puits.
Lorsque l’appareil est prêt, chargez la norme dans les deux voies les plus externes et les échantillons dans les voies moyennes avec 100 microlitres de chaque dilution appropriée par puits. Lorsque tous les échantillons ont été chargés, allumez la pompe à vide pendant deux minutes, avant d’arrêter le vide et de permettre aux échantillons de filtrer à travers la membrane par gravité. Après 10 minutes, bien laver chaque puits avec 100 microlitres de PBS.
Faire fonctionner la pompe à vide pendant encore cinq minutes. Lorsque le tampon de lavage s’est complètement vidé de l’appareil, pendant que le vide est en place, desserrez les vis et ouvrez soigneusement l’appareil à taches à points. Ensuite, traiter la membrane selon les protocoles standard de tache occidentale.
Pour l’analyse densitométrique du filtre, ouvrez ImageJ et définissez chaque point pour mesurer la densité intégrée à l’aide de la commande Analyser, mesurer comme démontré. Pour corriger l’image en arrière-plan, dessinez un cercle dans une zone vide et mesurez sa densité intégrée telle qu’elle est démontrée. Corréler la densité intégrée des points standard avec la quantité de protéines chargées pour obtenir une ligne d’étalonnage, et utiliser la courbe d’étalonnage pour extrapoler la concentration de mRFP de chaque point d’échantillon.
La concentration du mRFP restant dans les fractions non liées peut alors être calculée. La présence de protéines de la taille prévue seulement dans les voies chargées d’un extrait des spores adsorbed est indicative d’une réaction réussie d’adsorption. L’évaluation directe de l’efficacité de l’adsorption dépend de la protéine héterologeuse qui a été utilisée et peut être effectuée par microscopie de fluorescence et cytofluorimétrie de la fraction de granulés après la fractionnement de la réaction d’adsorption.
La quantification des signaux fluorescents présents sur les spores peut ensuite être effectuée à l’aide d’ImageJ comme démontré. Une analyse indirecte de l’efficacité de l’adsorption peut être effectuée par une analyse par ballonnement de points de la fraction supernatale contenant la protéine non léditée, et l’analyse densitométrique subséquente de la protéine non lédée permet le calcul indirect de la quantité de protéines adsorbées sur les spores. Bien que, en principe, toute protéine puisse être adsorbée pour être utilisé comme vaccins muqueux ou biocatalyseurs, dans la pratique, l’efficacité de l’adsorption dépend des sites protéiques et des propriétés chimiques.
