Живые бактериальные споры, отображающие антиген или ферменты, являются функционально активными наночастицами, которые могут быть использованы в качестве слизистых вакцин или биокаталинов. В принципе, любой белок может быть эффективно адсорбирован до спор. Этот метод прост и не требует каких-либо генетических манипуляций.
Таким образом, никакого высвобождения рекомбинантных организмов в окружающую среду не участвует. В дополнение к мукозальной вакцинологии для людей и животных, споры, отображающие ферменты могут быть разработаны в качестве многоразовых биокатализеров. Начните с маркировки два раза от 10 до девятого B.subtilis дикого типа очищенных спор с двумя-пять-или 10-микрограмм концентрации модели RFP в 200 микролитров связывающего буфера дополнен 50-миллимолярный цитрат натрия в течение одного часа при 25 градусов по Цельсию на качалке.
В конце инкубации гранулы связывающих смесей путем центрифугации, и передачи supernatants в новые конические трубки для последующего анализа эффективности adorption. Затем, мыть споры гранулы два раза с 200 микролитров связывания буфера на стирку, повторно гранулы в 100 микролитров свежего буфера связывания после второй стирки. Для экстракции поверхностного белка добавьте 50 микролитров каждого адсорбированного реуспензии спор до 50 микролитров 2X додекилового сульфата-дитиотреятола для растворения поверхностных спор белков.
После 45 минут при 65 градусах по Цельсию, собирать смеси центрифугации, и запустить 10 микролитров каждого объема извлеченных белков supernatant на западной пятно, используя моноклональные анти-Его антитела признавая Его тег присутствует на N-термин mRFP для выявления помечены поверхностных белков. Для локализации и количественной оценки адсорбированных молекул с помощью флуоресцентной микроскопии добавьте пять микролитров резуспензии адсорбированных спор до 95 микролитров PBS и добавьте пять микролитров каждого полученного суспензии на отдельные микроскопьные слайды. Поместите поли-L-лизин-обработанные крышки на каждом слайде, и поместите один слайд на стадии флуоресценции микроскопа.
Затем для каждого поля сохраните фазо-контрастные и флуоресцентные изображения микроскопии. Для анализа изображений откройте флуоресценцию микроскопии изображений в ImageJ, а также выберите изображение и тип, чтобы подтвердить, что все изображения находятся в восьми-битном формате. Из меню Анализа выберите измерения набора и подтвердите, что выбраны область, интегрированная плотность и среднее серое значение.
Используйте инструмент рисования или выбора, чтобы нарисовать линию вокруг спор, представляющих интерес, и выбрать меру из меню анализа. Появится всплывающее окно со стопкой значений для выбранной споры. После того, как по крайней мере 50 спор были выбраны, выберите несколько регионов без каких-либо спор, и повторить измерение, чтобы получить показания для фоновой флуоресценции.
После получения нескольких фоновых измерений скопируйте все данные в окне результатов в электронную таблицу и вычисляйте среднее среднее значения интегрированной плотности в области выбранных спор и фоновые значения флуоресценции для получения исправленной общей флуоресценции на клетку. Для косвенной оценки эффективности рекламы выполнить шесть двукратных серийных разбавления очищенных mRFP при концентрации 0,5 нанограмма на микролитр до конечного объема 250 микролитров на разбавление в связывающем буфере и соответствующее экспериментальное количество двукратных серийных разбавлений 100 микролитров каждого зарезервированного супернатантного образца, содержащего несвязанные mRFP фракции реакции adorption с 100 микролитров Затем вырежьте мембрану нитроцеллюлозы с вырезом 0,45 микрометра до размера размером 9 на 10 сантиметров, чтобы покрыть область разбавления размером пять образцов на шесть точек, не вытянувсь за пределы края прокладки точечного аппарата.
Поместите мембрану prewet в аппарат пятно точки. Проверьте правильный размер мембраны, и удалить любые пузырьки воздуха, оказавшихся между мембраной и прокладкой. Соберите точечный аппарат, описанный производителем, и покройте неиспользованную часть аппарата, чтобы предотвратить перемещение воздуха через эти скважины.
Когда аппарат будет готов, загрузите стандарт в двух самых внешних полосах движения и образцы в средних полосах со 100 микролитров каждого соответствующего разбавления на колодец. Когда все образцы были загружены, включите вакуумный насос в течение двух минут, прежде чем остановить вакуум и позволяет образцам фильтровать через мембрану под действием силы тяжести. Через 10 минут, мыть каждый хорошо с 100 микролитров PBS.
Запустите вакуумный насос еще на пять минут. Когда стиральный буфер полностью осушенных из аппарата, в то время как вакуум на, ослабить винты и тщательно открыть точку пятно аппарата. Затем обработать мембрану в соответствии со стандартными западными протоколами пятно.
Для денситометрического анализа фильтра откройте ImageJ и наметьте каждую точку для измерения интегрированной плотности с помощью команды Analyze, Measure, как попродемонстрировано. Чтобы сделать фоновую коррекцию изображения, нарисуйте круг в пустой области и измерьте его интегрированную плотность, как это было продемонстрировано. Соотносите интегрированную плотность стандартных точек с количеством загруженного белка для получения калибровочной линии и используйте кривую калибровки для экстраполяции концентрации mRFP каждой точки образца.
Затем можно рассчитать концентрацию mRFP, остающейся в несырьях фракциях. Наличие белков ожидаемого размера только в полосах, загруженных экстрактом адсорбных спор, свидетельствует об успешной реакции адсорбции. Прямая оценка эффективности асорпции зависит от гетерологозного белка, который был использован и может быть выполнен с помощью микроскопии флуоресценции и цитофториметрии фракции гранул после фракционирования реакции adorption.
Количественная оценка флуоресцентных сигналов, присутствующих на спорах, может быть выполнена с помощью ImageJ, как попродемонстрировано. Косвенный анализ эффективности адсорбции может быть выполнен путем точечного анализа супернатантной фракции, содержащей несъегодный белок, а последующий денситометрический анализ несъегодного белка позволяет косвенно вычислить количество белка, адсорбированного на споры. Хотя, в принципе, любой белок может быть адсорбирован для использования в качестве слизистых вакцин или биокаталистов, на практике эффективность адсорбции зависит от белковых участков и химических свойств.
