בהשוואה לשבר PSD, ניתן לזהות את החלבון הסינפטי הפועל על הסינפסה לא בוגרת סביב השבר העשיר בפילופודיה. השתמשנו בנוירון חי כדי לגרום להיווצרות כובע phagocytic. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לזהות חלבון פעיל בראשית מלאכותית מהשבר העשיר בפילופודיה דנדריטית.
כדי להתחיל, להכין 200x תערובת ויטמין על ידי המסת 100 מ"ג של ויטמין B5, 100 מ"ג כולין כלוריד, 100 מ"ג חומצה פולית, 180 מ"ג של I-אינוזיטול, 100 מ"ג של ויטמין B3, 100 מ"ג של ויטמין B6 הידרוכלוריד, ו 100 מ"ג של תיאמין הידרוכלוריד ב 500 מ"ל של מים אולטרהפלור באמצעות stirrer מגנטי. מערבבים בזהירות aliquot ב 50 מ"ל צינורות ולאחסן אותו ב 20 מעלות צלזיוס. כדי להכין פתרון ריבופלבין, להמיס 100 מ"ג ריבופלבין ב 500 מ"ג של מים אולטרה-חוץ באמצעות ערבוב מגנטי.
מערבבים בזהירות aliquot ב 50 מ"ל צינורות ולאחסן ב 20 מעלות צלזיוס. כדי להכין אחד דיכלוריד סידן טוחנת להמיס 7.35 גרם של סידן כלוריד דיהידראקט ב 50 מ"ל של מים אולטרהפלור באמצעות stirrer מגנטי. להכנה בינונית חיונית מינימלית יש להמיס 400 מ"ג אשלגן כלורי 6, 800 מ"ג סודום כלורי, 2, 200 מ"ג של סודיום ביקרבונט, 158 מ"ג של נתרן פוספט דיהידרט מונובסי, 7, 000 מ"ג של D-גלוקוז, ו 200 מ"ג של מגנזיום סולפט heptahydrate, ו 950 מ"ל של מים אולטרה פלור, באמצעות stirrer מגנטי.
לאחר מכן, השתמש פיפטה 1 מ"ל עם תסיסה מתמדת על stirrer מגנטי להוסיף 1.8 מיליליטר של 1 דיכלוריד סידן טוחנת MEM באופן טיפה על ידי טיפה. לאחר מכן מוסיפים חומצה הידרוכלורית כדי להתאים את ה- pH של ה- MEM ל- pH 7.25. לאחר מכן, מוסיפים 5 מ"ל של תערובת ויטמינים 200x ו 200 microliters של פתרון ריבופלבין ל- MEM.
כוונן את עוצמת הקול של הפתרון ל- 1000 מ"ל עם מים אולטרה-חמים. מסננים את הפתרון באמצעות מערכת סינון 0.22 מיקרון ומאחסנים אותו ב-4 מעלות צלזיוס. כדי להכין 10x DNase-1 פתרון מלאי להמיס 100 מ"ג של Dnase-1 ב 12.5 מ"ל של HBSS.
מסננים דרך מסנן 0.22 מיקרון, aliquot בצינורות 1.5 מ"ל, ולאחסן את הצינורות ב 20 מעלות צלזיוס. להכנת פתרון מלאי Ara-C להמיס 25 מ"ג של Ara-C ב 8.93 מ"ל של מים אולטרה ביטחון. מסננים דרך מסנן 0.22 מיקרון, aliquot בצינורות 1.5 מ"ל, ולאחסן ב 20 מעלות צלזיוס.
כדי להכין את מדיום ציפוי, לערבב 1 מ"ל של פתרון חומצת אמינו MEM, 750 מיקרוליטרים של 1 HEPES טוחנת, 1 מ"ל של B27, 125 microliters של 200 מילימולאר גלוטמין, 250 microliters של פניצילין סטרפטומיצין, 2.5 מ"ל של סרום שור עוברי, ו 44.375 מ"ל של MEM בצינור 50 מ"ל. כדי להכין את מדיום עצירה, לערבב 1 מ"ל של פתרון חומצת אמינו MEM, 750 microliters של 1 HEPES טוחנת, 5 מ"ל של FBS, ו 43.25 מ"ל של MEM בצינור 50 מ"ל. כדי להכין HBSS, בתוספת 15 מילימולרים HEPES, לערבב 49.25 מ"ל של HBSS, ו 750 microliters של 1 HEPES טוחנת.
להכנת מנות מצופות פולי-ל-ליסין, יש לצפות במנות תרבות תאי פלסטיק 35 מ"מ עם 0.2 מ"ג למ"ל של פולי-ל-ליסין הידרוברומיד ליום אחד ב-25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את הכלים עם 2 מ"ל של מים אולטרה לחץ שלוש פעמים דגירה אותם עם 1.5 מ"ל של עצור בינוני ב 25 מעלות צלזיוס עד השימוש. דגירה ההיפוקמפוס מנותח בתערובת המכילה 500 microliters כל אחד 2.5% טריפסין ו 10X Dnase-1 ב HBSS בתוספת 15 מילימולרים HEPES, pH 7.2, ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות עם תסיסה כל 3 דקות.
לאחר מכן, להעביר את ההיפוקמפוס ל 10 מ"ל של עצירה בינונית דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כדי להשבית טריפסין. לאחר מכן, הדגירה ההיפוקמפוס נותח ב 10 מ"ל של טרי להפסיק בינוני ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. מעבירים את ההיפוקמפוס ל-10 מ"ל של עצירה טרייה בינונית ומדגירה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות נוספות.
לאחר מכן, להעביר את ההיפוקמפוס לתוך 900 microliters של מדיום עצירה ו 100 microliters של 10X Dnase-1 בצינור 15 מ"ל. השתמש פיפטה 1 מ"ל כדי לנטרל את ההיפוקמפוס לתוך נוירונים מבודדים על ידי pipetting 20 פעמים. מוסיפים 9 מ"ל של ציפוי בינוני, ומסננים דרך מסננת תאים של 70 מיקרון, לצינור של 50 מ"ל.
לספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer ולהתאים ל 3.5 פעמים 10 לתאים הרביעי למיליליטר במדיום ציפוי. לאחר מכן, שאפו את מדיום העצירה מהמנות המצופות בפולי-ל-ליסטין. צלחת 2 מ"ל למנה של התאים על הכלים מצופים דגירה תחת 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60-64 שעות.
לאחר הדגירה, מוסיפים 2 מיקרוליטרים של פתרון מלאי Ara-C לנוירונים ומנערים את המנה לאט. שמור את מנות התרבות בקופסה לחה מבלי לשנות את מדיום התרבות תחת 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס. לטהר את שבר עשיר filopodia דנדריטי לאחר 13 ימים במבחנה על ידי תחילה הוספת שלושה מיליון microbeads פוליסטירן מגנטי לכל מנה ל 20 מנות המכילות את הנוירונים התרבותיים.
לאחר יום אחד, לשטוף את הנוירונים ב 1 מ"ל של PBS עם agiation שלוש פעמים כדי להסיר את microbeads בינוני ולא מאוגד. לאחר הסרת PBS, lyse הנוירונים עם 500 microliters לכל צלחת של מאגר תיזה. לאחר מכן, לאסוף את lysate עם מגרד תא ולהעביר את lysate לתוך 10 microtubes חלבון נמוך מחייב.
שים את הצינורות על מפריד מגנט ולחכות דקה אחת. לאסוף את supernatant ולהשתמש בו כשבר מאוגד עבור כתמי כסף וניתוח כתם מערבי. לאחר מכן, מעבירים את חרוזים למיקרו-צינור חדש מחייב חלבון נמוך ומגדירים על מפריד מגנטי למשך דקה אחת.
הסר לחלוטין את העל-טבעי והוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר התיזה. לשטוף את חרוזים באמצעות מערבל מערבולת במשך 15 שניות. חוזרים על שטיפת חרוזים 10 פעמים ומסירים את העל-טבעי.
חלבוני Elute עד חרוזים על ידי תוספת של 50 microliters של חיץ מדגם SDS 1X ולהרתיח את הצינור ב 98 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. צנטריפוגה הצינור ב 860xG 3000 סל"ד במשך 10 שניות ולהגדיר את הצינור על מפריד מגנטי במשך דקה אחת. לאסוף את supernatant ולהשתמש בו כשבר מאוגד.
מדדו את הריכוזים של שברי החלבון הלא מאוגדים והכרוגדים לפי מסקעת החלבון של BCA. דמיינו פתרונות פרוטאין עם כחול ברומופנים והתאימו את הריכוז ל-5 ננוגרם למיקרוליטר לעמוד SDS. הפרד את השברים המאוגדים והבלתי מאוגדים באמצעות דף SDS באמצעות ג'ל הדרגתי של 5-20%..
כסף מכתים את הג'ל. לבסוף, כתם מערבי באמצעות נוגדנים ראשוניים ומשניים מתאימים על פי כתב היד. בנוירונים מתורבתים בהיפוקמפוס, TLCN היה מקומי בשפע לפילופודיה דנדריטית, פיר, וסומה והיה מקומי במשותף עם F-actin.
חרוזים מקודדים היו קשורים בעיקר דנדריטים לגרום להיווצרות של כוסות phagocytic על ידי הצטברות של TLCN ו F-actin על דנדריטים עצביים. תמונות Thorecense הראו כי היווצרות phagocytic היה תלוי באופן מכריע על נוכחות של TLCN בדנדריטים. ה כוסות phagocytic נוצרו רק על נוירונים בהיפוקמפוס סוג פראי, אבל לא על TLCN נוירונים ההיפוקמפוס defficient.
תוצאות עמוד SDS הראו כי דפוסי רצועת החלבון היו כמעט זהים עבור שברים לא מאוגדים וכבולים אבל התעצמויות ב 50 ו 70 קילודאלטון, בשבר כבול היו נמוכים יותר מאלה בשבר מאוגד. עם זאת, עוצמת הלהקה לא הייתה שונה באופן ברור בין שברים לא מאוגדים וכבולים שהוכנו מתאי עצב בהיפוקמפוס של תרבות TLCN. ניתוח כתם מערבי של שברים לא מאוגדים וכבולים הראה כי TLCN ו- VN זוהו בעיקר בשבר המאוגד.
אקטין, עזרין, G אלפא q, PLC בטא 1, MAP-2, ו ספקטרין, זוהו הן שברים מאוגדים ולא מאוגדים. מוסין, PSD-95, אלפא-אקטין, ואלפא-טובלין זוהו בשבר הלא מאוגד. אם חלבון ציפוי של microbeads לשנות, הליך זה ניתן להחיל כדי לזהות אינטראקציה הבדיקה.
טכניקה זו יכולה לזהות את החלבון עובד על חומרים מלאכותיים. אז אנחנו מאמינים שניתן לכמת את המנגנון הזה. אנו מאמינים כי חלבון חדש הקשורים להפרעה נפשית ניתן לזהות מן השבר דנדריטי filopodia עשיר.
ו ניתן להאריך לטיפול.
