En comparación con la fracción PSD, puede ser posible identificar la proteína sináptica que actúa sobre la sinapsis inmadura alrededor de la fracción rica en filopodia dendrítica. Usamos neuronas vivas para inducir la formación de gorra fagocítica. La principal ventaja de esta técnica es que la proteína activa en la génesis artificial podría identificarse a partir de la fracción rica en filopodia dendrítica.
Para empezar, preparar 200x mezcla de vitaminas disolviendo 100 mg de vitamina B5, 100 mg de cloruro de colina, 100 mg de ácido fólico, 180 mg de I-inositol, 100 mg de vitamina B3, 100 mg de clorhidrato de vitamina B6, y 100 mg de clorhidrato de tiamina en 500 ml de agua ultrapura utilizando un agitador magnético. Mezcle cuidadosamente la alícuota en tubos de 50 ml y guárdelo a 20 grados centígrados. Para preparar la solución de riboflavina, disolver 100 mg de riboflavina en 500 mg de agua ultrapura utilizando un agitador magnético.
Mezcle cuidadosamente la alícuota en tubos de 50 ml y guárdelo a 20 grados centígrados. Para preparar un dicloruro de calcio molar disolver 7,35 gramos de cloruro de calcio dihidrato en 50 ml de agua ultrapura utilizando un agitador magnético. Para la preparación de Minimum Essential Medium disolver 400 mg de cloruro de potasio 6, 800 mg de cloruro de sodum, 2, 200 mg de bicarbonato de sodio, 158 mg de fosfato sódico monobásico dihidrato, 7, 000 mg de D-glucosa, y 200 mg de heptahidrato de sulfato de magnesio, y 950 ml de agua ultrapura, utilizando un agitador magnético.
A continuación, utilice una pipeta de 1 ml con una agitación constante en un agitador magnético para añadir 1,8 ml de 1 dicloruro de calcio molar al MEM de una manera gota por gota. A continuación, agregue ácido clorhídrico para ajustar el pH del MEM a pH 7.25. A continuación, añadir 5 ml de mezcla de vitaminas 200x y 200 microlitros de solución de riboflavina al MEM.
Ajustar el volumen de la solución a 1000 ml con agua ultrapura. Filtre la solución utilizando un sistema de filtro de 0,22 micras y guárdela a 4 grados centígrados. Para preparar 10x DNase-1 solución en stock disolver 100 mg de Dnase-1 en 12,5 ml de HBSS.
Filtrar a través de un filtro de 0,22 micras, alícuota en tubos de 1,5 ml, y almacenar los tubos a 20 grados centígrados. Para la preparación de la solución en stock de Ara-C disolver 25 mg de Ara-C en 8,93 ml de agua ultrapura. Filtrar a través de un filtro de 0,22 micras, alícuota en tubos de 1,5 ml y almacenar a 20 grados centígrados.
Para preparar el medio de chapado, mezclar 1 ml de mem amino acid Solution, 750 microlitros de 1 HEPES molar, 1 ml de B27, 125 microlitros de 200 milivolares glutamina, 250 microlitros de penicilina-estreptomicina, 2,5 ml de suero bovino fetal y 44,375 ml de MEM en un tubo de 50 ml. Para preparar el medio de parada, mezclar 1 ml de solución de aminoácidos MEM, 750 microlitros de 1 HEPES molar, 5 ml de FBS y 43,25 ml de MEM en un tubo de 50 ml. Para preparar HBSS, complementado con 15 HEPES mililolares, mezclar 49,25 ml de HBSS, y 750 microlitros de 1 HEPES molar.
Para la preparación de platos recubiertos de poli-l-lisina, cubra los platos de cultivo celular de plástico de 35 mm con 0,2 mg por ml de hidrobromuro de poli-l-lisina durante un día a 25 grados centígrados. A continuación, lavar los platos con 2 ml de agua ultrapura tres veces e incubarlos con 1,5 ml de Stop Medium a 25 grados centígrados hasta su uso. Incubar el hipocampo diseccionado en una mezcla que contenga 500 microlitros cada uno de 2.5%trypsin y 10X Dnase-1 en HBSS complementado con 15 HEPES mililolares, pH 7.2, a 37 grados Celsius durante 15 minutos con agitación cada 3 minutos.
Luego, transfiera el hipocampo a 10 ml del Medio Stop e incubar a 4 grados Celsius durante 5 minutos para inactivar la trippsina. A continuación, incubar el hipocampo diseccionado en 10 ml de medio de parada fresco a 4 grados centígrados durante 5 minutos. Mueva el hipocampo a 10 ml de medio de parada fresco e incubar a 4 grados centígrados durante otros 5 minutos.
A continuación, mueva el hipocampo a 900 microlitros del medio de parada y 100 microlitros de 10X Dnase-1 en un tubo de 15 ml. Utilice una pipeta de 1 ml para disociar el hipocampo en neuronas aisladas pipeteando 20 veces. Añadir 9 ml de medio de chapado, y filtrar a través de un colador celular de 70 micras, en un tubo de 50 ml.
Cuente el número de células usando un hemocitoómetro y ajuste a 3.5 veces 10 a las cuartas células por mililitro en medio de chapado. A continuación, aspirar el medio de parada de los platos recubiertos de poli-l-lisina. Plato 2 ml por plato de las células en los platos recubiertos e incubar menos de 5% dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante 60-64 horas.
Después de la incubación, añadir 2 microlitros de la solución de ara-C a las neuronas y agitar el plato lentamente. Mantenga los platos de cultivo en una caja humidificada sin cambiar el medio de cultivo por debajo del 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Purificar la fracción rica en filopodia dendrítica después de 13 días in vitro añadiendo primero tres millones de microbeads de poliestireno magnético por plato a 20 platos que contienen las neuronas cultivadas.
Después de un día, lavar las neuronas en 1 ml de PBS con agición tres veces para eliminar las micropersas medianas y no unidas. Después de eliminar PBS, ane las neuronas con 500 microlitros por plato del tampón de lisis. A continuación, recoger el izado con un rascador celular y transferir el izado a 10 microtubos de baja unión a proteínas.
Ponga los tubos en un separador de imán y espere un minuto. Recoger el sobrenadante y utilizarlo como la fracción sin ataduras para la tinción de plata y el análisis de manchas occidentales. A continuación, transfiera las perlas a un nuevo microtubo de unión a proteínas baja y establezca un separado magnético durante un minuto.
Retire completamente el sobrenadante y agregue 500 microlitros del búfer de lelisis. Lave las cuentas con un mezclador Vortex durante 15 segundos. Repita el lavado de las perlas 10 veces y retire el sobrenadante.
Eluir las proteínas hasta las cuentas por la adición de 50 microlitros de tampón de muestra 1X SDS y hervir el tubo a 98 grados Celsius durante 5 minutos. Centrifugar el tubo a 860xG 3000 RPM durante 10 segundos y ajuste el tubo en un separado magnético durante un minuto. Recoja el sobrenadante y utilícelo como fracción enlazada.
Mida las concentraciones de las fracciones de proteínas no unidas y unidas por el ensayo de proteína BCA. Visualice las soluciones protien con bromofenilo azul y ajuste la concentración a 5 nanogramos por microlitro para la página SDS. Separe las fracciones enlazadas y no enlazadas por la página SDS usando un gel de 5-20%gradiente.
La plata mancha el gel. Finalmente, Western blot utilizando anticuerpos primarios y secundarios apropiados de acuerdo con el manuscrito. En las neuronas del hipocampo cultivadas, TLCN fue abundantemente localizado a la filopodia dendrítica, eje, y soma y co-localizado con F-actina.
Las cuentas codificadas se unieron principalmente a dendritas e inducen la formación de copas fagocíticas por acumulación de TLCN y F-actin en dendritas neuronales. Las imágenes de Thorecense mostraron que la formación de la copa fagocítica dependía crucialmente de la presencia de TLCN en las dendritas. Las copas fagocíticas sólo se formaron en neuronas hipocampales de tipo salvaje, pero no en las neuronas hipocampales deficientes de TLCN.
Los resultados de la página SDS mostraron que los patrones de banda de proteína eran casi los mismos para las fracciones no enlazadas y enlazadas, pero las intensidades a 50 y 70 kilodalton, en la fracción enlazada eran inferiores a las de la fracción sin enlazar. Sin embargo, la intensidad de la banda no era obviamente diferente entre las fracciones no enlazadas y enlazadas preparadas a partir de las neuronas hipocampales de cultivo deficiente de TLCN. El análisis de la mancha occidental de las fracciones no enlazadas y enlazadas mostró que TLCN y VN se detectaron principalmente en la fracción enlazada.
Actin, Ezrin, G alfa q, PLC beta 1, MAP-2 y Spectrin, se detectaron tanto en las fracciones enlazadas como no enlazadas. Moesin, PSD-95, alfa-Actinin y alfa-Tubulina se detectaron en la fracción sin enlazar. Si la proteína de recubrimiento de las micropersas cambia, este procedimiento se puede aplicar para identificar la interacción del ensayo.
Esta técnica podría identificar la proteína que trabaja en sustancias artificiales. Así que creemos que la génesis artificial del mecanismo se puede cuantificar. Creemos que la nueva proteína asociada con el trastorno mental se puede identificar a partir de la fracción rica en filopodia dendrítica.
Y se puede extender a la terapia.
