PSD画分と比較して、樹状性フィロポディアリッチ分画の周りの未熟シナプスに作用するシナプスタンパク質を同定することができる。私たちは、貪食性キャップ形成を誘導するために生きたニューロンを使用しました。この技術の主な利点は、人工起源における活性タンパク質が樹状性フィロポディアリッチな画分から同定できることである。
始めるには、100mgのビタミンB5、100mgのコリンクロライド、100mgの葉酸、180mgのI-イノシトール、ビタミンB3100mg、ビタミンB6塩酸塩100mg、および100mgのチアミン塩酸塩を500mgの超純水系水質物酸塩に溶解させて200xビタミンミックスを調製します。50mlチューブにアリコートを慎重に混ぜ、摂氏20度で保存します。リボフラビン溶液を調製するには、磁気攪拌機を用いて500mgの超純水に100mgのリボフラビンを溶解する。
50mlチューブにアリコートを慎重に混ぜ、摂氏20度で保存してください。1モルの二塩化カルシウムを調製するために、磁気攪拌機を用いて50mlの超純水に塩化カルシウム二水和物7.35グラムを溶解する。最小必須培地調製のために溶解する塩化カリウムの400mg、塩化ソドゥムの800mg、2、200mgの重炭酸ナトリウム、158mgのリン酸ナトリウム単塩基二水和物、7、000mgのD-グルコース、および200mgの硫酸ヘプタ水和物、および950mlの超純水を使用して、アパラメを用いた。
次に、磁気攪拌機に一定の攪拌を伴う1mlピペットを使用して、滴下方式で1.8mlの二塩化カルシウム1.8mlをMEMに加えます。次に塩酸を加え、MEMのpHをpH7.25に調整します。次に、5 ml の 200x ビタミンミックスと 200 マイクロリットルのリボフラビン溶液を MEM に加えます。
溶液の体積を超純水で1000mlに調整します。0.22ミクロンのフィルターシステムを使用して溶液をフィルターし、摂氏4度で保存します。10x DNase-1ストック溶液を調製するために、100mgのDNA-1をHBSSの12.5mlに溶解する。
0.22ミクロンのフィルターを通してフィルター、1.5 mlの管のアリコート、および20°Cで管を貯える。Ara-Cストック溶液調製用に8.93mlの超純水に25mgのAra-Cを溶解する。0.22ミクロンのフィルター、1.5mlチューブのアリコートを通してフィルターし、摂氏20度で保存します。
メッキ培地を調製するには、1mlのMEMアミノ酸溶液、1モルHEPESの750マイクロリットル、B27の1ml、200ミリモルグルタミンの125マイクロリットル、ペニシリンストレプトマイシン250マイクロリットル、2.5mlの胎児牛血清、および44.375mlのMEM mlで混合する。停止培地を調製するために、MEMアミノ酸溶液1ml、1モルHEPESの750マイクロリットル、FBSの5ml、および43.25mlのMEMを50mlチューブに混合する。HBSSを調製するには、15ミリモルHEPESを補充し、49.25mlのHBSS、および1モルHEPESの750マイクロリットルを混合する。
ポリリジンコーティングされた皿の準備のために、25°Cで1日ポリl-リジン臭化水素化物のmlあたり0.2 mgで35ミリメートルプラスチック細胞培養皿をコーティングします。次に、2mlの超純水で皿を3回洗い、使用するまで摂氏25度で1.5mlのストップミディアムでインキュベートします。解剖された海馬を、HBSSの2.5%トリプシンと10X Dnase-1のそれぞれ500マイクロリットルを含む混合物でインキュベートし、15ミリモルHEPES、pH 7.2、37°Cで37度摂氏37度で3分毎に攪拌します。
その後、海馬をストップミディアムの10mlに移し、摂氏4度で5分間インキュベートしてトリプシンを不活性化します。次に、解剖した海馬を摂氏4度で10mlの新鮮な停止培地で5分間インキュベートする。海馬を10mlの新鮮な停止培地に移し、摂氏4度でさらに5分間インキュベートします。
次いで、海馬を停止培地の900マイクロリットルに、15mlチューブ内の10X Dnase-1の100マイクロリットルに移動させる。1 ml ピペットを使用して、海馬を分離ニューロンに 20 回ピペット化して分離します。9mlのメッキ培地を加え、70ミクロンの細胞ストレーナーを通して50mlのチューブにフィルターを入れる。
メッキ媒体中の1ミリリットル当たり4番目の細胞に3.5倍の10倍に調整して、ヘモサイトーメーターを使用して細胞の数を数えます。次に、ポリl-リジンコーティングされた食器から停止培地を吸引する。コーティングされた皿の細胞の皿あたりの皿あたり2mlを皿に入れ、60-64時間摂氏37度で5%の二酸化炭素の下でインキュベートする。
インキュベーションの後、ニューロンにAra-Cストック溶液の2マイクロリットルを加え、ゆっくりと皿を振ります。培養液を摂氏37度で5%の二酸化炭素の下で変えずに、加湿箱に入れておいてください。培養ニューロンを含む20皿に最初に1皿あたり300万個の磁気ポリスチレンマイクロビーズを追加して、インビトロで13日後に樹状フィロポディア豊富な分画を精製します。
1日後、1mlのPBSでニューロンを3回痛みで洗浄し、培地と非結合マイクロビーズを除去します。PBSを除去した後、リシスバッファーの1皿あたり500マイクロリットルでニューロンを溶精します。次に、細胞スクレーパーでライセートを回収し、10個の低タンパク質結合マイクロチューブにリセートを移す。
マグネットのセパライにチューブをセットし、1分間待ちます。上清を収集し、銀染色およびウェスタンブロット分析のための非結合分画として使用します。次に、ビーズを新しい低タンパク質結合マイクロチューブに移し、磁気分離器に1分間セットします。
上清を完全に取り除き、500マイクロリットルのリシスバッファーを加えます。渦ミキサーを使用してビーズを15秒間洗います。ビーズの洗浄を10回繰り返し、上清を取り除きます。
1X SDSサンプルバッファーの50マイクロリットルを添加してビーズにタンパク質を溶出し、5分間摂氏98度でチューブを沸騰させます。860xG 3000 RPMでチューブを10秒間遠心し、1分間磁気分離器にチューブをセットします。上清を収集し、バインドされた分数として使用します。
BCAタンパク質アッセイにより非結合および結合タンパク質画分の濃度を測定します。ブロモフェニルブルーでプロチエン溶液を視覚化し、SDSページのマイクロリットル当たり5ナノグラムに濃度を調整します。5~20%の勾配ゲルを使用して、SDSページでバインドされた分数と非結合分数を分離します。
銀染色ゲル。最後に、原稿に従って適切な一次および二次抗体を用いてウェスタンブロット。培養された海馬ニューロンにおいて、TLCNは樹状結腸状フィロポディア、シャフト、およびソーマに豊富に局在し、F-actinと共局化した。
コードされたビーズは主に樹状突起に結合し、神経樹状突起にTLCNおよびF-アクチンを蓄積することによって食作用性カップの形成を誘導した。Thorecense画像は、食細胞性カップ形成が樹状突起におけるTLCNの存在に極めて重要な依存していることを示した。食細胞性カップは野生型海馬ニューロンでのみ形成されたが、TLCNの非効率的な海馬ニューロンでは形成されなかった。
SDSページの結果は、タンパク質バンドパターンが非結合および結合画分でほぼ同じであったが、50キロおよび70キロダルトンでの強度は、結合された画分において非結合画分のそれよりも低いことを示した。しかし、バンド強度は、TLCN非効率的な培養海馬ニューロンから調製された非結合画分と結合画分の間で明らかに異ならなかった。非結合および結合画分のウェスタンブロット分析は、TLCNおよびVNが主に結合された画分で検出されたことを示した。
アクチン、エズリン、Gアルファq、PLCベータ1、MAP-2、およびスペクトリンは、結合画分と非結合画分の両方で検出された。モエシン、PSD-95、α-アクチニン、α-チューブリンは、非結合画分で検出された。マイクロビーズの被覆タンパク質が変化する場合、この手順はアッセイ相互作用を同定するために適用することができる。
この技術は、人工物質に取り組んでいるタンパク質を同定することができた。ですから、人工起源のメカニズムを定量化できると考えています。精神障害に関連する新しいタンパク質は、樹状性フィロポディアが豊富な分画から同定できると考えています。
そして、治療に拡張することができます。
