רקמת שומן כלי הדם מקיפה את כלי הדם ומווסתת את הפיזיולוגיה הלב וכלי הדם. פרוטוקול זה משמש כדי לענות על שאלות מפתח הקשורות לתפקוד של מגניטורים שומן אנושי microenvironment כלי הדם. תאי השומן משתנים בהתאם למיקום האנטומי שלהם.
אנו מראים כי אוכלוסייה של אאוגניטורים רב תכליתיים ניתן להפיק בהצלחה רקמת שומן כלי הדם מחולים עם מחלות לב וכלי דם. הדגמת ההליך תהיה ספנסר סקוט, סטודנט לרפואה מהמעבדה שלי. השג חתיכה של 500 מיליגרם של רקמת שומן כלי הדם האנושית או PVAT מחדר הניתוח כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
העבר PVAT אנושי טרי מ DMEM לצינור חרוט 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של פתרון אנטיביוטי. דגירה עם נדנדה במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בעוד PVAT הוא בת פתרון אנטיביוטי, להפשיר aliquot של חיץ דיסוציאציה ב 37 מעלות צלזיוס.
הוסף 50 microliters של 100x אנטיביוטיקה / פתרון אנטימיקוטי לחמישה מיליליטר של חיץ דיסוציאציה ועיקור באמצעות מסנן מזרק מיקרון 0.22. מוסיפים מיליליטר אחד של תוסף ג'לטין ל באר אחת של צלחת של 24 בארות. במכסה המנוע לזרימה למינארית, השתמש במטסים סטריליים ומספריים כדי להעביר PVAT מהתווית האנטיביוטית לצלחת פטרי סטרילית.
הוסף מיליליטר אחד של חיץ דיסוציאציה מחומם מראש לרקמה. טחון דק את הרקמה כולה לתוך תרחיף באמצעות מדפים סטריליים ומספריים ניתוח. מעבירים את תרחיף מיליליטר אחד לארבעה מיליליטר של חיץ דיסוציאציה.
הדגירה את הצינור על צידו בשייקר מסלולי מחומם מראש 37 מעלות צלזיוס ב 200 סל"ד במשך שעה אחת. לאחר שעה אחת, אין חתיכות רקמה גלוי צריך להיות נוכח הפתרון יופיע כמו השעיה תא מעונן. לסנן את הפתרון באמצעות מסננת תא 70 מיקרון להגדיר על גבי צינור חרוט 50 מיליליטר.
לשטוף את מסננת עם 10 מיליליטר נוספים של פתרון אנטיביוטי כדי ללכוד תאים רבים ככל האפשר. אל תלחץ על מסננת. עכשיו גלולה התאים במשך 12 דקות ב 300 פעמים g בצנטריפוגה דלי מתנדנד.
לאחר צנטריפוגה, הצינור יופרד לשכבה תחתית שומנית של אדיפוזיטים, אינטרפייס וכדור. גלולה היא שבר כלי דם סטרומה המכיל תאים אנדותל, תאים חיסוניים, תאי דם ותאי קדמון. תן שימוש חוזר את גלולה ב 10 מיליליטר של HBSS וצנטריפוגה במשך חמש דקות ב 300 פעמים g.
חזור על שלב זה עבור סך של שתי שטיפות ב- HBSS. עכשיו שאף את הג'לטין מצלחת של 24 בארות. יש לשטוף בעדינות את הגם פעם אחת עם HBSS כדי להסיר ג'לטין לא מאוגד.
תוריד מחדש את גלולת שבר כלי הדם הסטרומאליים עם תאי דם אדומים שלמים במיליליטר אחד של מדיום צמיחה וזרע על היטב מצופה ג'לטין. לאחר מכן להוסיף FGF2 אנושי לריכוז סופי של 25 ננוגרם למיליליטר במדיום תרבות. דגירה במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
לאחר גידול התאים במשך 24 שעות, להסיר את מדיית הצמיחה ולשטוף את התאים חמש פעמים עם HBSS. שלב כביסה זה מסיר תאי דם אדומים ותאים מתים. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של מדיה צמיחה טרי בתוספת 25 ננוגרם למיליליטר FGF2 לכל באר.
שנה את המדיה כל 48 שעות הקפד להשלים עם 25 ננוגרם למיליליטר FGF2 טרי בכל פעם. תאי מעבר ברגע שהם מגיעים 100% confluence שבעה עד 10 ימים לאחר explant. כדי לעשות זאת, שאפו את המדיה צמיחה ולשטוף את monolayer פעמיים עם HBSS מיליליטר אחד.
שאפו את כל HBSS מה בארות והוסיפו כמה טיפות של פתרון דיסוציאציה של תאים. הקש וסובב את הצלחת מספר פעמים ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 במשך חמש עד שבע דקות כדי להרים את התאים. לאחר מכן מוסיפים כמיליליטר של מדיום תרבות טרי לתאים המנותקים.
להפיץ 500 microliters של התאים המנותקים לשתי בארות של צלחת 24 באר כל מכיל 500 microliters של מדיה צמיחה ו 25 ננוגרם FGF2. כמו כן, תרבות מח עצם אנושי תאי גזע Mesenchymal או מושבות MSC כמתואר בפרוטוקול הטקסט. צלחת המספרים המתאימים של מח עצם ותאים נגזר PVAT לכל באר של צלחת 12 באר.
עבור תנאים אדיפוגניים ואוסטאוגניים, צלחת כ 200, 000 כדי 225, 000 תאים לגם. בעוד עבור תנאים כונדרוגניים, צלחת 150, 000 כדי 175, 000 תאים לגם. לאחר מכן לנתק תאים הן מאוכלוסיית תאי הצאצאים של PVAT האנושית והן מאוכלוסיית MSC מח העצם האנושית על ידי הוספת פתרון ניתוק תאים.
הדגירה את התאים בתסכול הניתוק ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 במשך חמש דקות. משוך את האוכלוסיות לתוך 15 בקבוקונים חרוטיים נפרדים מיליליטר. לסובב את הבקבוקונים למטה ב 500 פעמים g במשך שבע דקות כדי גלולה את התאים.
לאחר מכן השתמש שוב בתאים במיליליטר אחד של PBS ולהשתמש hemocytometer כדי להעריך את מספר התא. צלחת התאים ב 12 גם מנות כמו קודם. לספק מנות נפרדות עבור המושרה ולא המושרה תנאים אדיפוגניים ואוסטאוגניים.
ולהוסיף 1.5 מיליליטר של מדיה אדיפוגנית ואוסטיאוגנית ללכת לכל באר של המצב המושרה. לאחר מכן הוסיפו 1.5 מיליליטר של מדיה לא אינדוקציה אדיפוגנית ואוסטאוגנית לכל באר של המצב שאינו המושרה. התחל דגירה של אדיפוגנית אוסטאוגנית המושרה ואוכלוסיות תאים שאינם המושרה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5%CO2.
לסובב את הנפח הנותר של תאי PVAT אנושיים ו- MSCs מח עצם אנושי במשך שבע דקות ב 500 פעמים g. לקבוע את הנפח הדרוש כדי להשתמש מחדש את מח העצם הנותר כדורי תא נגזר PVAT כדי להשיג צפיפות של 100, 000 תאים לכל 10 microliters. לאחר מכן בצע שימוש חוזר כדורי בנפח המחושב של מדיה צמיחה MSC עבור אינדוקציה שושלת כונדרוגניים.
הזז בעדינות את עוצמת התאים למעלה ולמטה באמצעות פיפטה כדי להבטיח התפלגות הומוגנית. עכשיו פיפטה טיפה 10 microliter של פתרון התא המרוכז למרכז של כל באר כדי ליצור מסה מיקרו של 100, 000 תאים. מניחים מיליליטר אחד של מים סטריליים באר הסמוכה כדי למנוע אידוי.
הדגירה תרבויות מיקרו מסה במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 כדי לאפשר את המסה מיקרו לצבור. לאחר שעתיים, בזהירות להוסיף מדיה התברואה chondrogenic זינק עם 10 ננוגרם למיליליטר אנושי TGF-בטא-אחד לכל אחת בארות מצב המושרה. עכשיו בזהירות להוסיף 1.5 מיליליטר של מדיה אי אינדוקציה ל בארות מצב שאינם המושרה.
לגרד או לשפוך את מסת המיקרו במצב chondrogenic המושרה לתוך קלטת על מנת לייבש, להטביע, ולהכתים את המדגם כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מחקרי ההידול האדיפוגניים בוצעו במקביל לתאי MSC ומופקים ממח עצם אנושי ותאי גוף שמקורם ב- PVAT. במצב שאינו מושרה, אין הצטברות שומנים ניכרת.
זאת בניגוד למצב המושרה המוצג לאחר הכתמת שומנים ניטרליים עם שמן אדום O.בעוד מידת ההבחנה בתאים האנושיים שמקורם ב- PVAT היא חזקה יותר, שני מקורות התא האנושי הציגו את היכולת להבדיל בין שושלת השומן. פרוטוקול ההידול האוסטאוגני שימש עבור MSCs שמקורם במח העצם האנושי ותאים שמקורם ב- PVAT. תאים שאינם מושרה לא הכתימו עם אליזרין אדום.
לאחר פרוטוקול ההתברכות האוסטאוגנית, MSCs האנושיים פיתחו גושים הסתיידים שהוכתמו באדום אליזארין בעוד שתאי PVAT של האאורטיק האנושי לא. תאים שמקורם הן MSCs מח עצם אנושי PVAT האנושי הציג תכונות האופייניות ההתברלות chondrogenic עם הצטברות קולגן בשפע במסת מיקרו. מסה מיקרו נוצרת MSCs מח עצם אנושי ותאים שמקורם PVAT בירך גם הפגינו הצטברות בשפע של glycosaminoglycans כפי שצוין על ידי כתמים כחולים אלקיים.
מבחינה מורפולוגית, מבנים דומים ללקונה זוהו עם תאים יושבים בחללים מוקפים בתצהיר קולגן. זה קריטי כדי טחון דק רקמת שומן כלי דם לפני התנתקות אנזימטית כדי להבטיח צפיפות התא הנכון מצופים עבור כל מיפוי בידול שושלת. בעקבות הליך זה, PCR כמותי בשילוב עם כתם מערבי ציטומטריה זרימה יש להשתמש כדי לאפיין סמנים ספציפיים לשושלת של האבות מובחנים ממקורות שומן ומח עצם.
עם טכניקה זו, אנו יכולים להתחיל להבין את המנגנונים המסדירים את הרחבת רקמת השומן הדם וכלי הדם ואת תפקוד לקוי במהלך השמנת יתר ואת ההשלכות שיש לתאי אבי העורף על תפקוד כלי הדם ומחלות לב וכלי דם.
