Il tessuto adiposo perivascolare circonda i vasi sanguigni e regola la fisiologia cardiovascolare. Questo protocollo viene utilizzato per rispondere a domande chiave relative alla funzione dei progenitori di adiposi umani nel microambiente vascolare. Le cellule progenitrici adipose variano a seconda della loro posizione anatomica.
Mostriamo che una popolazione di progenitori multipotenti può essere derivata con successo dal tessuto adiposo perivascolare da pazienti con malattie cardiovascolari. A dimostrare la procedura sarà Spencer Scott, uno studente di medicina del mio laboratorio. Ottenere un pezzo da 500 milligrammi di tessuto adiposo periposo umano periposo o PVAT dalla sala operatoria come descritto nel protocollo di testo.
Trasferire il PVAT umano fresco da DMEM a un tubo conico da 50 millilitri contenente 25 millilitri di soluzione antibiotica. Incubare con dondolo per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Mentre il PVAT è in soluzione antibiotica, scongelare un'aliquota di tampone di dissociazione a 37 gradi Celsius.
Aggiungere 50 microlitri di soluzione antibiotico/antimicotica 100x a cinque millilitri di tampone di dissociazione e sterilizzare utilizzando un filtro siringa da 0,22 micron. Aggiungere un millilitro di soluzione di gelatina a un pozzo di un piatto da 24 pozzetto. In una cappa a flusso laminare, utilizzare pinza sterile e forbici per trasferire PVAT dalla soluzione antibiotica a una piastra di Petri sterile.
Aggiungere un millilitro di tampone di dissociazione pre-riscaldato al tessuto. Tritare finemente l'intero tessuto in un liquame usando forcelle sterili e forbici di dissezione. Trasferire il liquame da un millilitro a quattro millilitri di tampone di dissociazione.
Incubare il tubo su un lato in uno shaker orbitale pre-riscaldato di 37 gradi Celsius a 200 giri/min per un'ora. Dopo un'ora, non dovrebbero essere presenti pezzi di tessuto visibili e la soluzione apparirà come una sospensione cellulare torbide. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a celle da 70 micron impostato in cima a un tubo conico da 50 millilitri.
Risciacquare il colino con altri 10 millilitri di soluzione antibiotica per catturare il maggior numero possibile di cellule. Non spremere il colino. Ora pellet le cellule per 12 minuti a 300 volte g in una centrifuga a secchio oscillante.
Dopo la centrifugazione, il tubo verrà separato in uno strato superiore grasso di adipociti, un'interfase e un pellet. Il pellet è la frazione vascolare stromale contenente cellule endoteliali, cellule immunitarie, cellule del sangue e cellule progenitrici. Resuspend il pellet in 10 millilitri di HBSS e centrifuga per cinque minuti a 300 volte g.
Ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi in HBSS. Ora aspira la gelatina da un piatto da 24 po '. Lavare delicatamente il pozzo una volta con HBSS per rimuovere la gelatina non vincolata.
Rimossare il pellet di frazione vascolare stromale con globuli rossi intatti in un millilitro di mezzo di crescita e seminare sul pozzo rivestito di gelatina. Quindi aggiungere FGF2 umano a una concentrazione finale di 25 nanogrammi per millilitro nel mezzo di coltura. Incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius con il 5%CO2.
Dopo aver fatto crescere le cellule per 24 ore, rimuovere il mezzo di crescita e lavare le cellule cinque volte con HBSS. Questo passaggio di lavaggio rimuove i globuli rossi e i globuli morti. Quindi aggiungere un millilitro di mezzi di crescita freschi integrati con 25 nanogrammi per millilitro FGF2 ad ogni pozzo.
Cambia il supporto ogni 48 ore assicurandoti di integrare con 25 nanogrammi per millilitro FGF2 fresco ogni volta. Le cellule di passaggio una volta raggiunta la confluenza del 100% da sette a 10 giorni dopo l'espianto. Per fare ciò, aspirare i mezzi di crescita e lavare il monostrato due volte con un MILLILITRO HBSS.
Aspirare tutti gli HBSS dai pozzi e aggiungere alcune gocce di soluzione di dissociazione cellulare. Toccare e ruotare la piastra più volte e incubare a 37 gradi Celsius con 5%CO2 per cinque o sette minuti per sollevare le cellule. Quindi aggiungere circa un millilitro di mezzo di coltura fresco alle cellule staccate.
Distribuire 500 microlitri delle cellule staccate a due pozzi di una piastra da 24 porcili ciascuno contenente 500 microlitri di mezzi di crescita e 25 nanogrammi FGF2. Inoltre, coltura del midollo osseo umano Cellule Staminali Mesenchimali o colonie MSC come descritto nel protocollo di testo. Placcare il numero appropriato di midollo osseo e cellule derivate da PVAT per pozzo di una piastra di 12 po '.
Per condizioni adipogeniche e osteogeniche, placcare circa 200.000-225.000 cellule per pozzo. Mentre per le condizioni condrogeniche, piastra da 150.000 a 175.000 cellule per pozzo. Quindi dissociare le cellule sia dalla popolazione umana di cellule progenitrici PVAT che dalla popolazione msc del midollo osseo umano aggiungendo la soluzione di distacco cellulare.
Incubare le cellule nella soluzione di distacco a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per cinque minuti. Tirare le popolazioni in fiale coniche separate da 15 millilitri. Ruotare i flaconcini a 500 volte g per sette minuti per pellettare le cellule.
Quindi rimescolare le cellule in un millilitro di PBS e utilizzare un emocitometro per stimare il numero di cellule. Placcare le celle in 12 piatti bene come prima. Fornire piatti separati per le condizioni adipogeniche e osteogeniche indotte e non indotte.
E aggiungere 1,5 millilitri di mezzi di conduzione adipogenica e osteogenica ad ogni pozzo della condizione indotta. Quindi aggiungere 1,5 millilitri di mezzi adipogenici e osteogenici di non induzione ad ogni pozzo della condizione non indotta. Iniziare l'incubazione delle popolazioni cellulari indotte e non indotte adipogeniche e osteogeniche a 37 gradi Celsius e 5%CO2.
Spin down il volume rimanente di cellule progenitrici PVAT umane e MBC del midollo osseo umano per sette minuti a 500 volte g. Determinare il volume necessario per rimescolare il midollo osseo rimanente e i pellet cellulari derivati dal PVAT per ottenere una densità di 100.000 cellule per 10 microlitri. Quindi rimospendare i pellet nel volume calcolato dei mezzi di crescita MSC per l'induzione del lignaggio condrogenico.
Spostare delicatamente il volume delle celle su e giù utilizzando una pipetta per garantire una distribuzione omogenea. Ora pipettare una goccia da 10 microliter della soluzione cellulare concentrata al centro di ogni pozzo per formare una micro massa di 100.000 cellule. Posizionare un millilitro di acqua sterile nel pozzo adiacente per evitare l'evaporazione.
Incubare le micro colture di massa per due ore a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per consentire alla micro massa di aggregarsi. Dopo due ore, aggiungere attentamente i mezzi di differenziazione condrogenica con picco con 10 nanogrammi per millilitro umano TGF-beta-uno a ciascuno dei pozzi di condizione indotti. Ora aggiungere con cura 1,5 millilitri del supporto di non induzione ai pozzi di condizione non indotti.
Raschiare o versare la micro massa nella condizione condrogenica indotta in una cassetta per disidratare, incorporare e macchiare il campione come descritto nel protocollo di testo. Studi di differenziazione adipogenica sono stati eseguiti in parallelo con le cellule progenitrici derivate dal midollo osseo umano MSC e dal PVAT. Nella condizione non indotta, non è evidente alcun accumulo lipidico.
Questo è in contrasto con la condizione indotta mostrata dopo la colorazione di lipidi neutri con Oil Red O.Mentre il grado di differenziazione nelle cellule derivate dal PVAT aortico umano è più robusto, entrambe le fonti cellulari umane hanno mostrato la capacità di differenziare per il lignaggio adipogenico. Il protocollo di differenziazione osteogenica è stato utilizzato per i CBC derivati dal midollo osseo umano e per le cellule derivate dal PVAT. Le cellule non indotte non macchiavano con Alizarin Red.
Dopo il protocollo di differenziazione osteogenica, gli MSC umani svilupparono noduli calcificati che macchiavano di Rosso Alizarina mentre le cellule PVAT aortiche umane non lo facevano. Le cellule derivate sia dai CCC del midollo osseo umano che dal PVAT umano mostravano caratteristiche della differenziazione condrogenica con abbondante accumulo di collagene nella micro massa. La micro massa è formata da CBC del midollo osseo umano e le cellule derivate dal PVAT aortico hanno anche mostrato un abbondante accumulo di glicosaminoglicani come indicato dalla colorazione blu alciana.
Morfologicamente, strutture simili alle lacune sono state rilevate con cellule sedute in cavità circondate da deposizione di collagene. È fondamentale tritare finemente il tessuto adiposo periposo perivasculare prima della dissociazione enzimatica e garantire che siano placcate adeguate densità cellulari per ogni saggio di differenziazione del lignaggio. Seguendo questa procedura, la PCR quantitativa combinata con la western blot e la citometria di flusso dovrebbe essere utilizzata per caratterizzare marcatori specifici del lignaggio di progenitori differenziati da fonti di adiposo periposo e midollo osseo.
Con questa tecnica, possiamo iniziare a capire i meccanismi che regolano l'espansione e la disfunzione del tessuto adiposo perivascolare durante l'obesità e le implicazioni che le cellule progenitrici hanno sulla funzione vascolare e sulle malattie cardiovascolari.
