Периваскулярная жировая ткань окружает кровеносные сосуды и регулирует сердечно-сосудистую физиологию. Этот протокол используется для ответа на ключевые вопросы, связанные с функцией человеческих жировых прародителей в сосудистой микроокноронности. Клетки-предшественники adipose различаются в зависимости от их анатомического местоположения.
Мы показываем, что популяция мультипотентных прародителей может быть успешно получена из периваскулярной жировой ткани у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Демонстрацией процедуры будет Спенсер Скотт, студент-медик из моей лаборатории. Получить 500 миллиграмм кусок человека Perivascular жировой ткани или PVAT из операционной, как описано в текстовом протоколе.
Перенесите свежий человеческий PVAT из DMEM в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую 25 миллилитров раствора антибиотиков. Инкубировать с качания в течение 20 минут при четырех градусах по Цельсию. В то время как PVAT находится в растворе антибиотиков, оттепель aliquot буфера диссоциации на 37 градусов по Цельсию.
Добавьте 50 микролитров 100-кратного антибиотика/антимикотического раствора в пять миллилитров буфера диссоциации и стерилизовать с помощью фильтра шприца 0,22 микрона. Добавьте один миллилитр желатина раствора в один колодец из 24-хорошо пластины. В ламинарный капюшон потока, использовать стерильные миппы и ножницы для передачи PVAT от антибиотика раствор стерильной чашки Петри.
Добавьте в ткань один миллилитр предварительно разогретого буфера диссоциации. Мелко фарш всей ткани в суспензию с использованием стерильных типсов и ножницами вскрытия. Перенесите одноми миллилитровую суспензию на четыре миллилитров буфера диссоциации.
Инкубировать трубку на бок в предварительно разогретой 37 градусов по Цельсию орбитальный шейкер при 200 об / мин в течение одного часа. Через час видимых частей ткани присутствовать не должно, и раствор будет отображаться как облачная подвесная клетка. Фильтр раствор через 70 микрон клеток ситечко установить на вершине 50 миллилитров конической трубки.
Промыть ситечко с дополнительными 10 миллилитров раствора антибиотика, чтобы захватить как можно больше клеток, как это возможно. Не сжимайте сите ситечко. Теперь гранулы клеток в течение 12 минут при 300 раз г в размахивая центрифуги ведро.
После центрифугации трубка будет разделена на жирный верхний слой адипоцитов, интерфазы и гранулы. Гранулы стромальной сосудистой фракции, содержащей эндотелиальные клетки, иммунные клетки, клетки крови и клетки-предшественники. Переусердствойте гранулы в 10 миллилитров HBSS и центрифуги в течение пяти минут при 300 раз г.
Повторите этот шаг в общей сложности две стирки в HBSS. Теперь аспирировать желатин из 24-хорошо пластины. Аккуратно мыть хорошо один раз с HBSS для удаления несвего желатина.
Resuspend стромальной сосудистой фракции гранулы с нетронутыми красными кровяными клетками в один миллилитр среднего роста и семян на желатин покрытием хорошо. Затем добавьте FGF2 человека к окончательной концентрации 25 нанограмм на миллилитр в среде культуры. Инкубировать в течение 24 часов при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2.
После роста клеток в течение 24 часов, удалить рост средств массовой информации и мыть клетки пять раз с HBSS. Этот шаг стирки удаляет красные кровяные тельца и мертвые клетки. Затем добавьте один миллилитр свежих средств роста, дополненный 25 нанограммами на миллилитр FGF2 к каждой хорошо.
Изменение средств массовой информации каждые 48 часов убедившись, что дополнить 25 нанограмм на миллилитр свежих FGF2 каждый раз. Проходные клетки, как только они достигают 100% слияния от семи до 10 дней после экспланта. Для этого аспирируют средства роста и мыть монослой дважды одним миллилитровым HBSS.
Аспирировать все HBSS из скважин и добавить несколько капель раствора диссоциации клеток. Нажмите и вихрем пластины несколько раз и инкубировать при 37 градусов по Цельсию с 5%CO2 в течение пяти-семи минут, чтобы поднять клетки. Затем добавьте приблизительно один миллилитр свежей среды культуры к отделенным клеткам.
Распределим 500 микролитров отдельных клеток на две скважины из 24-колодцев, каждая из которых содержит 500 микролитров средств роста и 25 нанограмм FGF2. Кроме того, культура человеческого костного мозга Мезенхимальные стволовые клетки или MSC колоний, как описано в текстовом протоколе. Плита соответствующие номера костного мозга и PVAT-производных клеток на колодец 12-хорошо пластины.
Для адипогенных и остеогенных состояний, пластины примерно 200 000 до 225 000 клеток на колодец. В то время как для хондрогенных условий, пластины 150000 до 175000 клеток на колодец. Затем отмежевать клетки как от популяции клеток-предшественников человека PVAT, так и от популяции MSC костного мозга человека, добавляя раствор клеточного отслоения.
Инкубировать клетки в растворе отслоения при 37 градусах Цельсия и 5%CO2 в течение пяти минут. Потяните популяции в отдельные 15 миллилитровых конических флаконов. Спин флаконы вниз на 500 раз g в течение семи минут, чтобы гранулы клеток.
Затем повторное использование клеток в один миллилитр PBS и использовать гемоцитометр для оценки числа клеток. Плита клетки в 12-хорошо блюда, как и раньше. Обеспечить отдельные блюда для индуцированных и не индуцированных адипогенных и остеогенных условиях.
И добавить 1,5 миллилитров адипогенных и остеогенных средств проводимой к каждой колодец индуцированного состояния. Затем добавьте 1,5 миллилитров адипогенных и остеогенных неиндукционных средств к каждому колодец неиндуцированных состояний. Начните инкубацию адипогенных и остеогенных индуцированных и неиндуцированных популяций клеток при 37 градусах Цельсия и 5%CO2.
Спин вниз оставшийся объем человеческих клеток-предшественников PVAT и человеческого костного мозга MSCs в течение семи минут в 500 раз г. Определите объем, необходимый для повторного перерасхода оставшегося костного мозга и гранул клеток, полученных из PVAT, для достижения плотности 100 000 клеток на 10 микролитров. Затем повторное использование гранул в расчетном объеме средств роста MSC для индукции хондрогенной линии.
Аккуратно переместите объем ячеек вверх и вниз с помощью пипетки, чтобы обеспечить однородное распределение. Теперь пипетка 10 микролитров капли концентрированного клеточного раствора в центре каждой хорошо, чтобы сформировать микро-массу 100000 клеток. Поместите один миллилитр стерильной воды в соседний колодец, чтобы предотвратить испарение.
Инкубировать микро-массы культур в течение двух часов при 37 градусов по Цельсию и 5%CO2, чтобы микро-массы для агрегирования. Через два часа, тщательно добавить хондрогенной дифференциации средств массовой информации шипами с 10 нанограмм на миллилитр человека TGF-бета-один к каждому из индуцированных состояния скважин. Теперь аккуратно добавьте 1,5 миллилитров неиндукционных средств к неиндуцированным состояниям скважин.
Очистить или залить микро-массу в индуцированном хондрогенном состоянии в кассету, чтобы обезвоживать, вставлять и окрашивать образец, описанный в текстовом протоколе. Исследования адипогенной дифференциации проводились параллельно с клетками-предшественниками, полученными из костного мозга человека, и клетками-предшественниками, полученными из PVAT. В неиндуцированных условиях, нет накопления липидов очевидна.
Это в отличие от индуцированного состояния показано после окрашивания нейтральных липидов с маслом красный O.While степень дифференциации в человеческой аорты PVAT полученных клеток является более надежным, как человеческие источники клеток продемонстрировали способность дифференцировать для адипогенической линии. Протокол остеогенной дифференциации использовался для клеток, полученных из костного мозга человека, и клеток, полученных из ПВАТ. Неинндуцированные клетки не окрашивали Алисарин Красный.
После протокола остеогенной дифференциации, человеческие MSCs разработали кальцифицированные узелки, которые окрашены Alizarin Красный в то время как человеческие клетки аорты PVAT не сделал. Клетки, полученные как из человеческого костного мозга MSCs и человека PVAT отображается особенности, характерные для хондрогенной дифференциации с обильным накоплением коллагена в микро-массы. Микро масса образуется из человеческого костного мозга MSCs и аорты PVAT полученных клеток также выставлены обильное накопление гликозаминогликканов, как указано на Alcian Blue окрашивания.
Морфологически структуры, похожие на лакуны, были обнаружены с клетками, сидящими в полости, окруженные осаждением коллагена. Очень важно, чтобы мелко фарш периваскулярной жировой ткани до энзиматической диссоциации и обеспечить надлежащее плотность клеток помылись для каждой линии дифференциации анализа. После этой процедуры, количественные ПЦР в сочетании с западной помарки и цитометрии потока должны быть использованы для характеристики линии конкретных маркеров дифференцированных прародителей из периваскулярных жировой и костного мозга источников.
С помощью этого метода, мы можем начать понимать механизмы, регулирующие перивазкулярного расширения жировой ткани и дисфункции во время ожирения и последствия, которые клетки-предшественники имеют на сосудистой функции и сердечно-сосудистых заболеваний.
