지방 분지 조직은 혈관을 둘러싸고 심혈관 생리학을 조절합니다. 이 프로토콜은 혈관 미세 환경에서 인간 지방 선조의 기능과 관련된 주요 질문에 대답하는 데 사용됩니다. 지방 전구 세포는 해부학적 위치에 따라 다릅니다.
우리는 다능한 선조의 인구가 심혈관 질병을 가진 환자에게서 심분 지방 조직에서 성공적으로 파생될 수 있다는 것을 보여줍니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 의대생 인 스펜서 스콧이 될 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 수술실에서 인간 인분면 지방 조직 또는 PVAT의 500 밀리그램 조각을 가져옵니다.
DMEM에서 항생제 용액 25 밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 원내 튜브로 신선한 인간 PVAT를 전송합니다. 섭씨 4도에서 20분 동안 흔들면 배양하세요. PVAT는 항생제 용액에있는 동안, 섭씨 37도에서 해리 버퍼의 알리쿼시를 해동.
100x 항생제/항진화 용액 50마이크로리터를 5밀리리터의 해리 버퍼에 추가하고 0.22 미크론 주사기 필터를 사용하여 살균합니다. 24웰 플레이트의 한 웰에 젤라틴 용액 1밀리리터를 추가합니다. 라미나르 플로우 후드에서 멸균 집게와 가위를 사용하여 항생제 용액에서 멸균 페트리 접시로 PVAT를 전송합니다.
조직에 미리 따뜻해지는 해리 버퍼 1밀리리터를 추가합니다. 멸균 집게와 해부 가위를 사용하여 전체 조직을 슬러리로 미세하게 다진다. 1 밀리리터 슬러리를 4밀리리터의 해리 버퍼로 옮기습니다.
1시간 동안 200rpm에서 미리 따뜻워진 섭씨 37도 의 궤도 셰이커로 튜브를 배양합니다. 1 시간 후에 눈에 보이는 조직 조각이 없어야하며 용액이 흐린 세포 현탁액으로 나타납니다. 50 밀리리터 원원형 튜브 꼭대기에 놓인 70마이크론 세포 스트레이너를 통해 용액을 필터링합니다.
가능한 한 많은 세포를 포착하기 위해 항생제 용액의 추가 10 밀리리터로 여과기를 헹구세요. 스트레이너를 짜내지 마십시오. 이제 스윙 버킷 원심분리기에서 300배 g에서 12분 동안 세포를 펠릿합니다.
원심분리 후, 튜브는 지방상 층, 상간 및 펠릿으로 분리됩니다. 펠릿은 내피 세포, 면역 세포, 혈액 세포 및 선조 세포를 포함하는 기질 혈관 분획입니다. 300배g에서 5분간 HBSS와 원심분리기의 10밀리리터에서 펠릿을 다시 분리합니다.
HBSS에서 총 2개의 세치에 대해 이 단계를 반복합니다. 이제 24웰 플레이트에서 젤라틴을 흡인합니다. HBSS로 한 번 잘 부드럽게 씻고 바운드되지 않은 젤라틴을 제거합니다.
기질 혈관 분획 펠릿을 그대로 적혈구로 재중단하고 성장 배지의 1 밀리리터에 씨를 잘 뿌린다. 그런 다음 인간 FGF2를 배양 배지에서 밀리리터당 25 나노그램의 최종 농도에 추가합니다. 5%의 CO2로 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하세요.
24 시간 동안 세포를 성장 한 후, 성장 매체를 제거하고 HBSS로 세포를 다섯 번 세척. 이 세척 단계는 적혈구와 죽은 세포를 제거합니다. 그런 다음 각 웰에 밀리리터 FGF2 당 25 나노그램으로 보충된 신선한 성장 매체의 1밀리리터를 추가합니다.
매 번 미디어를 변경 48 시간 으로 보충 하는 확인 25 밀리 리터 신선한 FGF2 때마다 나노 그램. 통로 세포는 일단 100%에 도달하면 병절 후에 7 10 일 합류합니다. 이렇게하려면 성장 매체를 흡인하고 단일 층을 1 밀리리터 HBSS로 두 번 씻으세요.
우물에서 모든 HBSS를 흡인하고 세포 해리 솔루션의 몇 방울을 추가합니다. 접시를 여러 번 탭하고 소용돌이치는 경우 37도에서 5%의 CO2로 배양하여 세포를 들어 올립니다. 그런 다음 분리 된 세포에 신선한 배양 배지의 약 1 밀리리터를 추가합니다.
분리된 세포의 500마이크로리터를 각각 24웰 플레이트의 2개의 우물에 분배하여 500마이크로리터의 성장 매체와 25나노그램 FGF2를 함유하고 있다. 또한, 문체 프로토콜에 기재된 바와 같이 인간 골수 골수 중년줄기 세포 또는 MSC 콜로니를 배양한다. 12웰 플레이트의 웰당 골수 및 PVAT 유래 세포의 적절한 숫자를 플레이트.
선화 및 골성 질환의 경우, 약 200, 000 ~ 225, 000 세포당 플레이트. 연골 질환의 경우, 플레이트 150, 000 ~ 175, 000 세포가 잘 생성됩니다. 그런 다음 세포 분리 용액을 추가하여 인간 PVAT 전구 세포 집단과 인간 골수 MSC 인구 모두에서 세포를 분리합니다.
분리 용액의 세포를 섭씨 37도, CO2 5%에서 5분간 배양합니다. 인구를 별도의 15 밀리리터 원물 바이알로 끌어당깁니다. 바이알을 500배 g로 7분간 회전하여 세포를 펠릿합니다.
그런 다음 PBS의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 혈종계를 사용하여 세포 수를 추정합니다. 이전과 같이 12 웰 요리에 세포를 접시. 유도 및 비 유도 된 비 유도 된 선화 및 골성 조건에 대 한 별도 접시를 제공 합니다.
그리고 유도된 상태의 각 웰에 1.5 밀리리터의 선포성 및 골성 전도 성 전도 성 매체를 추가한다. 그런 다음 비 유도되지 않은 상태의 각 웰에 1.5 밀리리터의 선포겐성 및 골성 비 유도 매체를 추가합니다. 섭씨 37도 및 5%CO2에서 비자극성 및 골성 유도 및 비유도 세포 집단의 배양을 시작합니다.
인간 PVAT 전구 세포와 인간 골수 MSC의 남은 부피를 500배 g에서 7분간 스핀다운합니다. 10 마이크로리터 당 100, 000 세포의 밀도를 달성하기 위해 나머지 골수와 PVAT 유래 세포 펠릿을 다시 중단하는 데 필요한 부피를 결정합니다. 그런 다음 연골계계 유도를 위해 MSC 성장 매체의 계산된 부피에서 펠릿을 재중단한다.
피펫을 사용하여 셀의 부피를 위아래로 부드럽게 이동하여 균질 분포를 보장합니다. 이제 파이펫은 농축 된 세포 용액의 10 마이크로 리터 액액을 각 우물의 중심으로 하여 100, 000 세포의 마이크로 질량을 형성합니다. 증발을 방지하기 위해 인접한 우물에 멸균 수1 밀리리터를 놓습니다.
마이크로 질량을 집계할 수 있도록 섭씨 37도, CO2 5%에서 2시간 동안 마이크로 질량 배양을 배양합니다. 2 시간 후, 신중하게 유도 된 상태 우물각각에 밀리리터 인간 TGF 베타 -1 당 10 나노 그램으로 스파이크 연골 생성 분화 매체를 추가합니다. 이제 비 유도 매체의 1.5 밀리리터를 유도되지 않은 상태 우물에 신중하게 추가합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 시료를 탈수, 임베드 및 얼룩시키기 위해 유도된 연골학적 조건에서 마이크로 질량을 긁어내거나 카세트로 부었다. 아디포겐성 분화 연구는 인간 골수 유래 MSC 및 PVAT 유래 전구 세포와 병행하여 수행하였다. 유도되지 않은 상태에서지질 축적이 분명하지 않습니다.
이는 오일 레드 O.와 중성 지질의 염색 에 따른 유도된 상태와 는 대조적으로, 인간 대동맥 PVAT 유래 세포에서 분화의 정도가 더 견고하지만, 두 인간 세포 소스 모두 사이포원 혈통을 분화하는 능력을 나타냈다. 골성 분화 프로토콜은 인간 골수 유래 MSC 및 PVAT 유래 세포에 사용되었다. 유도되지 않은 세포는 Alizarin Red로 얼룩지지 않았습니다.
골성 분화 프로토콜 후, 인간 MSC는 인간 대동맥 PVAT 세포가 하지 않는 동안 알리자린 레드로 염색석석질 결절을 개발했습니다. 인간 골수 MSC와 인간 PVAT 모두에서 유래된 세포는 마이크로 질량에 풍부한 콜라겐 축적을 통해 연골분화의 특징을 나타냈다. 마이크로 질량은 인간 골수 MSC및 대동맥 PVAT 유래 세포에서 형성되어 알시안 블루 염색에 의해 표시된 글리코사미노 글리칸의 풍부한 축적을 나타낸다.
형태학적으로, 라쿠나에 유사한 구조물은 콜라겐 증착에 둘러싸인 구멍에 앉아있는 세포로 검출되었다. 효소 분리 전에 체분 지방 조직을 미세하게 다진 하고 각 계보 분화 분석에 대해 적절한 세포 밀도가 도금되도록 하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 서양 블롯 및 유동 세포측정과 결합된 정량적인 PCR은 각지방 및 골수 소스로부터 분화된 선조의 계보 특이적 마커를 특성화하기 위해 사용되어야 합니다.
이 기술로, 우리는 비만 도중 지방 조직 확장 및 기능 장애를 인식하는 기계장치 및 전구 세포가 혈관 기능 및 심장 혈관 질병에 있다는 것을 이해하기 시작할 수 있습니다.
