פרוטוקול זה מדגים שיטה חדשנית לעריכת גנום מולטיפלקס של Cerevisiae Saccharomyces על ידי החדרת קלטות ביטוי מרובות על loci שונים בשלב טרנספורמציה אחת. גישת הרכבה פלסמידית חופשית לשיבוט להבעת מערך crRNA יחיד, מובילה לפרוטוקול עריכת גנום מהיר, יעיל וגמיש. אנו מהנדסים תאי שמרים מסוג בר, כדי לייצר קרוטנואידים על ידי החדרת גנים הטרולוגיים בחינם על לוקוסים גנומיים בחינם.
מערך crRNA יחיד מורכב crRNAs בודדים חינם לידי ביטוי מיזם RNA פולימראז חינם. Cas12a מעבד ב vivo מערך crRNA לתוך crRNAs בודדים. CRRNAs מדריך Cas12a אל לוצי היעד על ה-DNA הגנומי שבו Cas12a מציג שבירות גדיל כפול.
שברי דנ"א כלפי מטה משתלבים מחדש לשילוב מחדש של vivo ומשתלבים בדנ"א גנומי. הפגנת הפרוטוקול תהיה קלאודיה Ciurkot, סטודנט לדוקטורט. ג'פרי ואן ווייק, מדען שותף.
וברנדה וונק, מדענית עמיתה בכירה מהמעבדה שלנו. לאחר קבלת מערך crRNA יחיד לניסויים בעריכת גנום מולטיפלקס של דנ"א סינתטי, הכינו את תערובת ההגברה של PCR, וטען את המערך לתוך התרמוצ'ילר להגברה. כדי לנתח את מוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה, הפעל את הדגימות על ג'ל 0.8% agarose ב 5 V / cm במשך 40 דקות.
לטעון את סולם ה-DNA עם שברי ה-DNA החל 100 10000 זוגות בסיס ואז לטהר את מוצרי PCR באמצעות ערכת טיהור PCR על פי ההוראות של היצרן. עבור טרנספורמציה שמרים, להתחיל על ידי טרום culturing סוג בר שמרים בבקבוק 100 מ"ל המכיל 20 מ"ל של תמצית שמרים פפטון דקסטרוז או YEPD בינוני. עבור דגירה לילה, ב 30 מעלות צלזיוס, ו 250 סיבובים לדקה למחרת בבוקר, לחסן 20 מ"ל של מדיום YEPD טרי עם נפח מחושב של שמרים טרום תרבות לילה.
מניחים את התרבות באינקובטור רועד עד צפיפות אופטית של 1.0, נמדד ב 600 ננומטר הוא הגיע. לקצור את תאי השמרים על ידי צנטריפוגה. לשטוף את גלולת תא שמרים ב 20 מ"ל של מים demineralized טמפרטורת החדר, ואחריו צנטריפוגה נוספת.
תן את גלולה ב 100 microliters של פתרון ליתיום אצטט טריס-EDTA, ולהעביר את השמרים לצינור microcentrifuge. מערבבים חמישה מיקרוליטרים של דנ"א נושא חד-גדילי ומיקרוגרם אחד של pCSN067 פלסמיד עם ההשעיה של תאי השמרים. לאחר מכן מערבבים 600 מיקרוליטרים של פתרון פוליאתילן גליקול LiAc-TE עם הדגימה.
דגירה תאי שמרים פלסמיד במשך 30 דקות ב 30 מעלות צלזיוס ו 450 prm בבלוק חום העליון שולחן. בסוף הדגירה, מערבבים 70 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד עם פתרון הטרנספורמציה. החום מזעזע את התערובת במשך 15 דקות באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס.
מעבירים את התערובת לצינור תחתון עגול 15 מ"ל. הוסף 10 מ"ל של YEPD לצינור עבור דגירה לילה ב 30 מעלות צלזיוס ו 250 סל"ד. למחרת בבוקר, לאסוף את התאים שהשתנו על ידי צנטריפוגה, ושואפים את כל מלבד 200 microliters הסופי של supernatant.
תן מחדש את גלולת תאי השמרים שהשתנתה בשארית העל-טבעית. צלחת 150 microliters של תערובת הטרנספורמציה, ו 150 microliters של דילול 20 פעמים של 50 microliters הנותרים של תערובת טרנספורמציה ב YEPD, על צלחות אגר YEPD, בתוספת 0.2 גרם לליטר של G418. לאחר 48 עד 72 שעות ב-30 מעלות צלזיוס, בחרו טרנספורמנט יחיד לפסים מחדש על צלחת אגר חדשה של YEPD בתוספת 0.2 גר'/ל' של G418.
עבור השינוי השני, להגדיל את התרבות לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר של 1.0, כפי שהוכח רק. ולהוסיף 20 מיקרוליטרים של תאים לצינור מיקרוצנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה, תן שימוש חוזר לכדור התא ב- 100 מיקרוליטרים של פתרון LiAc-TE והוסף ssDNA.
בצינור נפרד, שלבו מיקרוגרם אחד של מערך ה-CRRNA הבודד, מיקרוגרם אחד של פלסמיד הנמען ליניארי עבור מערך ה-CRRNA, מיקרוגרם אחד של כל דנ"א תורם, ומיקרוגרם אחד של כל אזור איגוף. לאחר מכן להעביר את תערובת ה-DNA לצינור של תאי שמרים מוסמכים ולהשלים את השינוי השני כפי שהוכח עבור השינוי הראשון. למחרת בבוקר, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ולתלות מחדש את גלולה ב aliquot קטן של על טבעי.
ואז צלחת 150 microliters של תערובת טרנספורמציה, ו 150 microliters של דילול 20 פעמים של תערובת הטרנספורמציה במדיום YEPD, על צלחות אגר YEPD בתוספת 0.2 g/ L G418, ו 0.2 g / L nourseothricin לאחר 48 עד 72 שעות, ב 30 מעלות צלזיוס, לבחור טרנספורמנט בצבע אחד עבור פסים מחדש על צלחת YEPD חדשה כדי להשיג מושבות צבעוניות בודדות. כדי לקבוע את יעילות עריכת הגנום, ספור את מספר המושבות הצבעוניות והלבנות על לוחות השינוי, וחלק את מספר המושבות הצבעוניות במספר המושבות הכולל. ליצירת אמנות פיקסל שמרים, יש לחסן בקבוקוני טלטול בודדים של 500 מ"ל המכילים 100 מ"ל של מדיום YEPD עם שלושה זני קרוטנואידים בצבעים שונים המייצרים זני S.cerevisiae, וסוג פראי CEN.
זן PK113-7D. הדגירה את התרבויות לילה ב 30 מעלות צלזיוס עם רועד ב 250 סל"ד. העבר 0.5 מ"ל של כל תרבות לילה לצינורות בודדים המכילים 0.5 מ"ל של בינוני שיפוע סטרילי ולא יוני לכל צינור, ומערבבים בקצרה את הפתרונות על ידי מערבולת.
העבר את המתלים התא בודדים, מאגר מוסמך 2 על ידי 3 בארות. השתמש בקובץ csv עם הגדרת כיול נוזלים 6RES_AQ_GPSA2 על מכשיר מטפל בנוזל אקוסטי כדי לזהות 25 ננוליטרים של כל זן S.cerevisiae מצלחת המקור המתאימה של המאגר המוסמך למיקרופלאט יעד 6144 המכיל 50 מ"ל של אגר YEPD. כאשר כל בארות כבר הבחינו, דגירה microplate ב 30 degress צלזיוס במשך 48 שעות.
כדי להגביר את הצבעים של הזנים, לאחסן את צלחות אגר ב 4 מעלות צלזיוס לפחות 72 שעות. תמונה של רוזלינד פרנקלין הופיעה על הצלחת. כפי שהוכח, ניתן להרכיב מקדם, מסגרת קריאה פתוחה, שליחות קטלנית ושני רצפי מחברים רציפים של 50 bp לקלטת ביטוי באמצעות תגובת שיבוט שער הזהב, ולאמת אותם על-ידי PCR.
לאחר הגברה של מערך crRNA יחיד על ידי PCR, פלסמיד הנמען עבור מערך crRNA יחיד הוא ליניארי כפי שאושר על ידי אלקטרופורזה. היעילות של עריכת הגנום מולטיפלקס ניתן לחשב על ידי אחוז המושבות הצבעוניות לאחר השינוי, ועל ידי התוצאות של ניתוחי PCR המאשרים את השילוב של DNA התורם במקומות DNA גנומי המיועד. לדוגמה, החל מתמונה בשחור לבן של רוזלינד פרנקלין, נוצרה תמונה בארבעה צבעים ורשימת איתור ששימשה אז כדי לזהות את ארבעת זנים שמרים שונים על מיקרופלסטיק אגר באמצעות מטפל נוזלי אקוסטי, כפי שהוכח, וכתוצאה מכך ציור שמרים ברזולוציה גבוהה של המדען.
לשינוי זה, השתמש בפתרונות טריים ובשברי דנ"א באיכות גבוהה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם עבור כניסת מולטיפלקס של מחיקות מוגדרות מוטציות הצבע לתוך DNA גנומי. בנוסף, ניתן לבצע ניסויי ויסות CRISPR.
ניתן לשנות שיטה זו כדי להציג יותר crRNAs חינם בתוך מערך כדי להגדיל את מספר שינויים בו זמנית שניתן לבצע.
