פרוטוקול זה מקל על הבידוד של תת-קבוצות פיברובלסט נפרדות מבחינה תפקודית מעור אנושי על-ידי מיון FAC בהתבסס על ביטוי סמן פני התא. בפעם הראשונה, פיברובלסטים papillary ו reticular ניתן לבודד ישירות מן העור ללא מניפולציה במבחנה. זוהי התקדמות עצומה בהשוואה לשיטות בידוד שהוקמו בעבר באמצעות תרבויות explant.
תת-קבוצות פיברובלסט עוריות מטפחות פונקציות נפרדות בתנאים הומיאוסטטיים. בעזרת כלי זה, ניתן לחקור הבדלים תפקודיים בפתולוגיות העור, כולל סרטן או מחלות עור דלקתיות. מאז הטיפול ברקמה האנושית דורש תרגול כלשהו כדי להשיג תשואות תאים משביע רצון, ברצוננו לספק הדגמה חזותית כדי להקל ולהאיץ את התהליך הזה.
כדי להכין דרמי בעובי מלא, מניחים פיסת עור אנושית על נייר מסנן עבה עם האפידרמיס פונה כלפי מטה. החזק את האפידרמיס בחוזקה עם מטלטולים, ולגרד את שכבת השומן תת עורית עם אזמל. לאחר מכן, פורסים את הרקמה לרצועות ברוחב חמישה מילימטרים לפני שמכניסים אותם לצלחת פטרי.
כדי לקטע את הדרמיס לשכבות papillary ו הרשתית, מניחים פיסת עור על נייר מסנן עבה עם האפידרמיס פונה כלפי מעלה. החזיקו את העור בחוזקה על קצותיו בממטרים, וחתכו קטע בעובי של 300 מיקרומטר בעזרת דרמטום חשמלי. מעבירים את השכבה הראשונה המורכבת מאפידרמיס ודרמיס פפילי לצלחת פטרי.
לאחר מכן, להמשיך מיד כדי להפריד את האפידרמיס ואת הדרמיס, או להוסיף 1x PBS כדי לשמור על הרקמה מפני התייבשות. לאחר מכן, להתאים את הדרמטום לעובי חיתוך של 700 מיקרומטר, לחתוך את הדרמיס הנותרים. מניחים את הפרוסה העליונה, המוגדרת כדרמיס הרשתית העליונה, בצלחת פטרי נפרדת.
לאחר מכן, לגרד את שכבת השומן התת עורית עם אזמל מן השכבה העורית הרשתית התחתונה שיורית, ולהשליך אותו. לאסוף את הדרמיס הרשתית התחתונה בצלחת פטרי אחרת. המשך מיד להליך עיכול אנזימטי, או להוסיף 1x PBS כדי לשמור על הרקמה מפני התייבשות.
כדי לבצע עיכול אנזימטי, מניחים את רצועות העור של חמישה מילימטרים או את האפידרמיס / papillary dermis עם האפידרמיס פונה כלפי מעלה בצלחת פטרי עם 10 מיליליטר של פתרון האנזים ניתוב. לאחר מכן, הדגירה את צלחת פטרי ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, מעבירים את האפידרמיס/דרמיס papillary למכסה של צלחת פטרי.
הפרד את האפידרמיס מהדרמיס העליון עם שני מדפים, שכל אחד מהם מחזיק את קצה הדרמיס. לאחר מכן, טחון כל שכבה עורית ביסודיות רבה ככל האפשר. ככל שהחתיכות קטנות יותר, כך עיכול הרקמה טוב יותר.
לאחר מכן, להכין את תערובת העיכול. מעבירים את הרקמה הטחון עם 10 מילימטרים של תערובת העיכול המוכנה לצינור 50 מ"מ. דגירה הרקמה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת תחת תסיסה.
להפוך את הצינור מספר פעמים במהלך העיכול. כדי להכין השעיה חד-תאית, יש להפסיק את עיכול הרקמה האנזימטית על-ידי הוספת 10 מיליליטר של מדיום פיברובלסט לרקמה המתעכלת על הקרח. לאחר מכן, יוצקים את התוכן של כל צינור דרך מסננת תה סטרילי רגיל, ולאסוף את ההשעיה התא בצלחת פטרי נקי.
לשטוף את מסננת עם בינוני, ולמועך את חתיכות רקמה מעוכל עם קצה של בוכנה מזרק. לאחר מכן, פיפטה ההשעיה התא שנאסף דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור 50 מיליליטר. לשטוף את מסננת התא עם בינוני, ולאסוף זרימה דרך אותו צינור.
לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור ב 500 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הסר את supernatant, ולשטוף את גלולת התא עם חמישה מיליליטר של מדיום fibroblast. חזור שוב על שלב הצנטריפוגה.
לאחר מכן, להסיר את supernatant, ולתלות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של חיץ תזה אריתרוסיטים ACK. השאירו את התאים במאגר תזה למשך דקה בערך בטמפרטורת הסביבה. לאחר מכן, עצור תזה על ידי הוספת תשעה מיליליטר של 1x PBS עם 10%FCS.
צנטריפוגה הצינור שוב ב 500 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולהשליך את העל טבעי לאחר מכן. לאחר התאים כבר מוכתמים עבור מיון FAC בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים, למיין שלושה subpopulations fibroblast לתוך צינורות microcentrifuge נפרדים מלא גם עם 350 microliters של מאגר תמוגה לבידוד RNA או 350 microliters של מדיום צמיחה fibroblast עבור תאים. להפוך את הצינורות מיד, או לשים את צינורות חיץ תזה לתוך חנקן נוזלי, או לשים את צינורות בינוניים צמיחה fibroblast על קרח.
בעקבות FACS, לסובב את התאים למטה ב 500 פעמים g במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, צלחת כמות שווה של תאים במדיום צמיחה fibroblast בצלחת תרבות תאים 24 היטב, ולהשאיר אותם לגדול עד שהם מגיעים 70% confluency. לאחר מכן, החלף את מדיום התאים התרבותיים במדיום ההבחנה של adipocyte, והתן לתאים להבדיל במשך 14 יום.
ביום ההתברמות 14, תקן את התאים עם 4%PFA למשך 20 דקות. לשטוף את בארות עם 60% isopropanol, ולתת לו להתאדות לחלוטין. לאחר מכן, להכתים את התאים עם חמישה מילימולרים של שמן מסונן אדום O במשך 20 דקות.
לאחר 20 דקות, לשטוף את התאים המוכתמים ארבע פעמים עם מים מזוקקים. תמונה התאים שקועים במים עם מיקרוסקופ הפוך ב 10x הגדלה עם אור משודר. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של שלוש אוכלוסיות פיברובלסט בעור האדם, המציג לוקליזציה תוך עורית שונה, פרופילי ביטוי גנים ותפקודים שונים.
FAP חיובי CD90 שלילי מועשרים בדרמיס papillary, ואילו FAP חיובי CD90 חיובי FAP שלילי CD90 חיובי הם בשפע יותר בדרמיס הרשתית. כל שלושת תת-התת-תפוקות ממוינות מציגות מורפולוגיה פיברובלסטית טיפוסית על התרבות במשך שבעה ימים. מעניין, הם מתנהגים אחרת בהבטחה adipogenesis.
לאחר 14 ימים בתרבות, FAP חיובי CD90 שלילי אינם מתבדלים adipocytes, בעוד FAP חיובי CD90 חיובי FAP שלילי CD90 חיובי בקלות לעבור adipogenesis. פרופיל ביטוי גנים מראה כי תאים שליליים ל-CD90 חיוביים ל-FAP מבטאים רמות גבוהות של סמנים המיוחסים בדרך כלל לפיברובלסטים פפילריים, כגון CD26, NTN ו- PDPN, בעוד שתאים חיוביים ל- CD90 מבטאים את סמני הרשתית הידועים, כגון CD36, אקטין שריר חלק וגמא PPAR ברמות גבוהות. אנו מסיקים שתאים שליליים ל-CD90 חיוביים FAP שייכים לתאי הפפילריים וה-CD90 החיוביים שייכים לשושלת הרשתית.
העיכול פועל בצורה הטובה ביותר אם חתיכות עורי הם טחון ביסודיות דגירה בכמות מספקת של אמצעי עיכול. תת-קבוצות פיברובלסט עוריות מגוונות מבחינה תפקודית. חקירת תפקידם בהקשר של מחלת פתוגנזה תסלול את הדרך להתערבויות אבחון וטיפוליות חדשות.
