このプロトコルは、細胞表面マーカー発現に基づくFAC選別によるヒト皮膚からの機能的に異なる線維芽細胞サブセットの分離を促進する。初めて、乳頭および網状線維芽細胞は、インビトロ操作なしで皮膚から直接単離することができる。これは、外植培養を用いた従来の分離法と比較して大きな進歩です。
皮膚線維芽細胞サブセットは、恒常性条件下で明確な機能を収容する。このツールを使用すると、癌または炎症性皮膚疾患を含む皮膚病理の機能的な違いを調査することが可能である。ヒト組織の取り扱いには、満足のいく細胞収量を達成するためのいくつかの練習が必要なため、このプロセスを促進し、加速するための視覚的なデモンストレーションを提供したいと考えています。
完全な厚さの真皮を準備するには、表皮が下向きの厚いろ紙の上に人間の皮膚を置きます。表皮を鉗子でしっかりと保持し、皮下脂肪層をメスで削り取ります。その後、ペトリ皿に入れる前に、組織を5ミリメートル幅のストリップにスライスします。
真皮を乳頭層と網状層に切り離すために、表皮を上向きにした厚い濾過紙の上に皮膚を置きます。鉗子で皮膚をしっかりと縁に持ち、300マイクロメートルの厚さの部分を電気皮膚膜でスライスします。表皮と乳頭真皮からなる第1層をペトリ皿に移します。
次いで、表皮と真皮を分離するために直ちに進むか、組織が乾燥するのを防ぐために1x PBSを加える。次に、皮膚膜を700マイクロメートルの切断厚さに調整し、残りの真皮をスライスします。上部の網状真皮として定義されている上のスライスを別のペトリ皿に入れます。
続いて、残りの下側網状皮層からメスで皮下脂肪層を削り取り、廃棄する。別のペトリ皿に下部網状真皮を収集します。酵素消化手順に直ちに進むか、1x PBSを加え、組織が乾燥しないようにします。
酵素消化を行うために、5ミリメートルの皮膚ストリップまたは表皮を上向きにした表皮/乳頭真皮を、解離酵素溶液の10ミリリットルのペトリ皿に置きます。その後、ペトリ皿を摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、表皮/乳頭真皮をペトリ皿の蓋に移します。
表皮を上真皮から2つの鉗子で分離し、それぞれ真皮の端を保持する。その後、各真皮層をできるだけ十分にミンチする。小さいほど、組織消化が良くなります。
その後、消化ミックスを準備します。調製した消化ミックスの10ミリメートルで細かく組織を50ミリメートルのチューブに移します。37°Cで組織を攪拌下で1時間インキュベートする。
消化中にチューブを数回反転させます。単細胞懸濁液を調製するために、氷上の消化された組織に10ミリリットルの線維芽細胞培地を加えることによって酵素組織消化を停止する。次に、各チューブの内容物を通常の滅菌ステンレスティーストレーナーを通して注ぎ、きれいなペトリ皿に細胞懸濁液を集める。
ストレーナーをミディアムで洗い、注射器プランジャーの端で未消化の組織片をつぶします。その後、収集した細胞懸濁液を70マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルのチューブにピペットを送る。培地で細胞ストレーナーをすすい、同じチューブを通して流れを集めます。
その後、チューブを摂氏4度で500倍にして10分間遠心する。上清を取り除き、5ミリリットルの線維芽細胞培地で細胞ペレットを洗浄する。遠心分離のステップを再度繰り返します。
その後、上清を取り除き、1ミリリットルのACK赤血球ライシス緩衝液中のペレットを再懸濁させた。周囲温度で約1分間、細胞をリシスバッファーに入れておきます。次に、10%FCSで9ミリリットルの1x PBSを加えて溶出を停止する。
再び500倍のgで5分間摂氏4度でチューブを遠心し、その後上清を捨てます。標準的なプロトコルに従ってFAC選別のために細胞が染色された後、RNA単離のための350マイクロリットルのライシスバッファーまたは細胞培養用の線維芽細胞増殖培地の350マイクロリットルで満たされた別々のマイクロ遠心分離管に3つの線維芽細胞亜集団を選別する。チューブを直ちに反転させ、リシス緩衝管を液体窒素に入れるか、または線維芽細胞成長培地チューブを氷の上に置きます。
FACSに続いて、セルを摂氏4度で3分間500倍gで回転させます。次に、24ウェル細胞培養皿に同量の線維芽細胞増殖培地に同量の細胞をプレートし、70%の合流まで増殖させる。次に、培養細胞培地をアディポサイト分化培地に置き換え、細胞を14日間分化させた。
分化14日目に、細胞を4%PFAで20分間固定する。60%イソプロパノールで井戸を洗い、完全に蒸発させます。その後、ろ過したオイルレッドOの5ミリモルで細胞を20分間染色します。
20分後、染色した細胞を蒸留水で4回洗います。透過光で10倍の倍率で反転顕微鏡で水中に浸した細胞を画像化します。このプロトコルは、異なる皮内局在化、遺伝子発現プロファイル、および機能を有するヒト皮膚における3つの線維芽細胞集団の同定を可能にする。
FAP陽性CD90陰性は乳頭真皮に富み、FAP陽性CD90陽性およびFAP陰性CD90陽性は、網状真皮に豊富である。3つの分類された亜集団はすべて、7日間培養時に典型的な線維芽細胞形態を示す。興味深いことに、彼らは脂質生成アッセイで異なる振る舞いがします。
培養で14日後、FAP陽性CD90陰性は、脂質細胞に分化せず、FAP陽性CD90陽性およびFAP陰性CD90陽性は容易に脂質生成を受ける。遺伝子発現プロファイリングは、FAP陽性CD90陰性細胞がCD26、NTN、PDPNなどの乳頭線維芽細胞に一般的に起因する高レベルのマーカーを発現し、CD90陽性細胞はCD36、平滑筋アクチン、PPAR-γなどの既知の網状マーカーを高レベルで発現することを示している。我々は、FAP陽性CD90陰性細胞が乳頭に属し、CD90陽性細胞が網状系統に属すると結論付ける。
消化酵素は、真皮部分を十分にミンチし、十分な量の消化培地でインキュベートする場合に最適です。皮膚線維芽細胞サブセットは機能的に多様である。病気の病因の文脈でそれらの機能を探求することは、新しい診断および治療介入への道を開くだろう。
