Este protocolo facilita o isolamento de subconjuntos de fibroblasto funcionalmente distintos da pele humana por triagem FAC com base na expressão do marcador de superfície celular. Pela primeira vez, fibroblastos papilares e reticulares podem ser isolados diretamente da pele sem manipulação in vitro. Este é um grande avanço em comparação com métodos de isolamento previamente estabelecidos usando culturas explant.
Subconjuntos de fibroblastos dérmicos abrigam funções distintas sob condições homeostáticas. Com esta ferramenta, é possível investigar diferenças funcionais em patologias da pele, incluindo câncer ou doenças inflamatórias da pele. Uma vez que o manuseio do tecido humano requer alguma prática para atingir rendimentos celulares satisfatórios, gostaríamos de fornecer uma demonstração visual para facilitar e acelerar esse processo.
Para preparar a derme de espessura total, coloque um pedaço de pele humana em um papel filtro espesso com a epiderme voltada para baixo. Segure a epiderme firmemente com fórceps, e raspe a camada de gordura subcutânea com um bisturi. Em seguida, corte o tecido em tiras de cinco milímetros de largura antes de colocá-los em uma placa de Petri.
Para secionar a derme em camadas papilares e reticulares, coloque um pedaço de pele em um papel filtro espesso com a epiderme voltada para cima. Segure a pele firmemente em suas bordas com fórceps, e corte uma seção de espessura de 300 micrômetros com uma dermatome elétrica. Transfira a primeira camada composta de epiderme e derme papilar para uma placa de Petri.
Em seguida, proceda imediatamente para separar a epiderme e a derme, ou adicionar 1x PBS para evitar que o tecido seque. Em seguida, ajuste a dermatome a uma espessura de corte de 700 micrômetros, e corte a derme restante. Coloque a fatia superior, que é definida como a dermis reticular superior, em uma placa de Petri separada.
Posteriormente, raspe a camada de gordura subcutânea com um bisturi da camada dérmica reticular residual inferior e descarte-a. Colete a dermis reticular inferior em outra placa de Petri. Prossiga imediatamente para o procedimento de digestão enzimática, ou adicione 1x PBS para evitar que o tecido seque.
Para realizar a digestão enzimática, coloque as tiras de pele de cinco milímetros ou a derme epiderme/papilar com a epiderme voltada para cima em uma placa de Petri com 10 mililitros da solução dissociante da enzima. Em seguida, incubar a placa de Petri a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, transfira a derme epiderme/papilar para a tampa da placa de Petri.
Separe a epiderme da derme superior com dois fórceps, cada um segurando a borda da derme. Posteriormente, pique cada camada dérmica o mais minuciosamente possível. Quanto menores os pedaços, melhor a digestão tecidual.
Em seguida, prepare a mistura de digestão. Transfira o tecido picado com 10 milímetros da mistura de digestão preparada em um tubo de 50 milímetros. Incubar o tecido a 37 graus Celsius por uma hora sob agitação.
Inverta o tubo várias vezes durante a digestão. Para preparar uma suspensão unicelular, pare a digestão enzimática do tecido adicionando 10 mililitros de meio de fibroblasto ao tecido digerido no gelo. Em seguida, despeje o conteúdo de cada tubo através de um filtro de chá inoxidável estéril regular, e colete a suspensão da célula em uma placa de Petri limpa.
Lave o coador com médio e amasse as peças de tecido não digeridas com a borda de um êmbolo de seringa. Depois, pipeta a suspensão celular coletada através de um coador de células de 70 micrômetros em um tubo de 50 milímetros. Enxágüe o coador celular com meio e colete fluxo através do mesmo tubo.
Em seguida, centrifugar o tubo a 500 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos. Remova o supernatante e lave a pelota celular com cinco mililitros de meio fibroblasto. Repita o passo da centrifugação novamente.
Depois, remova o supernascimento e resuspenja a pelota em um mililitro de tampão de lise eritrócito ACK. Deixe as células em tampão de lise por aproximadamente um minuto a temperatura ambiente. Em seguida, pare a lise adicionando nove mililitros de 1x PBS com 10% de FCS.
Centrifugar o tubo novamente a 500 vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos, e descartar o sobrenante posteriormente. Depois que as células foram manchadas para a classificação FAC seguindo protocolos padrão, classifique três subpopulações de fibroblasto em tubos de microcentrifuuge separados preenchidos com 350 microliters de tampão de lise para isolamento de RNA ou 350 microliters de meio de crescimento de fibroblasto para cultura celular. Inverta os tubos imediatamente, e coloque os tubos tampão de lise em nitrogênio líquido, ou coloque os tubos médios de crescimento do fibroblasto no gelo.
Seguindo o FACS, gire as células para baixo a 500 vezes g por três minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, aplaque uma quantidade igual de células em meio de crescimento de fibroblasto em um prato de cultura celular de 24 poços, e deixe-as crescer até atingir 70% de confluência. Em seguida, substitua o meio de célula cultivada por meio de diferenciação de adipócito, e deixe as células se diferenciarem por 14 dias.
No dia 14 de diferenciação, fixe as células com 4%PFA por 20 minutos. Lave os poços com 60% de isopropanol e deixe evaporar completamente. Em seguida, colorifique as células com cinco milimólares de Óleo Vermelho Filtrado por 20 minutos.
Após 20 minutos, lave as células manchadas quatro vezes com água destilada. Imagem as células imersas em água com um microscópio invertido a 10x de ampliação com luz transmitida. Este protocolo permite a identificação de três populações de fibroblastos na pele humana, que apresenta diferentes localizações intradérmicas, perfis de expressão genética e funções.
O CD90-negativo fap-positivo é enriquecido na dermis papilar, enquanto o CD90-positivo fap-positivo e o CD90-positivo fap-negativo são mais abundantes na dermis reticular. Todas as três subpopulações classificadas exibem morfologia típica do fibroblasto sobre a cultura durante sete dias. Curiosamente, eles se comportam de forma diferente em um ensaio de adipogênese.
Após 14 dias na cultura, o CD90-negativo fap positivo não se diferencia em adipócitos, enquanto o CD90-positivo fap-positivo e o CD90-positivo fap-negativo passam prontamente à adipogênese. O perfil da expressão genética mostra que as células CD90-negativas fap-positivas expressam altos níveis de marcadores comumente atribuídos a fibroblastos papilares, como CD26, NTN e PDPN, enquanto células CD90-positivas expressam os marcadores reticulares conhecidos, como CD36, actina muscular suave e PPAR-gama em níveis elevados. Concluímos que as células CD90-negativas FAP-positivas pertencem às células papilar e CD90-positivas pertencem à linhagem reticular.
A digestão funciona melhor se as peças dérmicas forem completamente picadas e incubadas em uma quantidade suficiente de meio de digestão. Subconjuntos de fibroblastos dérmicos são funcionalmente diversos. Explorar sua função no contexto da patogênese da doença abrirá caminho para novas intervenções diagnósticas e terapêuticas.
